Synthesis and characterization of I-gel
X-DNA (X01-X04 DNA strands) の4種類のオリゴヌクレチオドは Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA) によって商業的に合成されたものであった。 X-DNA配列（補足表5）は、文献に記載されている手順と同じ手順で設計、調製、特性評価を行い、若干の修正を加えた10,13。 1μmolスケールで凍結乾燥したDNA鎖を、14,000 g、15秒、室温で遠心分離することにより回収した。 各DNA鎖を1x TE buffer (pH 8.0) に1.0 mM濃度で再懸濁させた。 各チューブをMULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) を用いて1500 rpmで3時間振とう混合し、凍結乾燥オリゴヌクレオチドを完全に溶解させた。 各 DNA 鎖の 0.05 μmol (50 μl) を 1.5 ml チューブに合わせ、オリゴヌクレオチド混合物の総量が 500 μl になるようにヌクレアスフリーの水を加えた。 オリゴヌクレオチド混合物100μlを0.5mlチューブに分注した。 チューブをサーモサイクラー（Bio-Rad, CA, USA）内に設置した。 4種類のオリゴヌクレオチド（X01〜04）を以下の条件でアニールした：95℃で10分間の初期変性；そして65℃で2分間、60℃で5.5分間、その温度で1分間維持して1℃ずつ低下、20℃で30秒間、そして4℃まで低下させてX-DNAの安定化および保存に使用した。 その後、緩衝液交換のため、微量遠心用フィルターユニット（3kDa Mw cutoff）内のアニーリングしたX-DNA溶液（500μl）を15000g、4℃で6時間遠心して溶媒量を減少させた。 フィルターユニットを新しい遠心管に移した。 合計100μlの約4℃のヌクレアーゼフリー水をフィルターユニットに添加した。 フィルターユニットを15,000g、4℃で4時間遠心分離し、X-DNAに残存する塩類をリンスした。 カットオフフィルターモジュールは、チューブに逆さに入れ、2000g、4℃で3分間遠心する。 X-DNAの残留塩を完全に除去するために、同じ遠心チューブを用いて、無核水の添加と遠心分離をさらに2回行う。 X-DNA溶液の最終量は、〜300μlとなる。 siRNA発現プラスミド（I-プラスミド）は、Cosmo Genetech社（韓国、ソウル）から購入し、maxi-preparedとした。 Iゲルを構築するために、Iプラスミドを制限酵素BamHIを用いて直鎖化した。 siRNA遺伝子のサイズは、スペーサーを含めて66 bp（またはT7プロモーターを含めて498 bp）であった（I-プラスミドマップは補足図4を参照）。 サンプルの DNA 量は、BioSpectrometer (Eppendorf, Hamburg, Germany) を用いて UV/Vis 吸収値から求めた。 まず、X-DNAと線状プラスミドをT4 DNA ligase (Promega, Madison, WI, USA)の存在下で所定のモル比で混合し、Dgelを合成した。 X-DNA:I-plasmid の比率が 1500:1 の場合、30 μL の反応容積に 75 μM の X-DNA を 10.5 μL と 100 nM の plasmid を 5.25 μL 用いた。 Blank-gel実験では、I-gelと同量のX-DNA材料をT4 DNA ligaseでライゲーションした。 各サンプル10μLを2μLのゲルローディングバッファーと混合し、0.7または2%のアガロースゲルで100V、60分間電気泳動した。 すべての DNA (X-DNA, I-plasmid, Blank-gel, I-gel) をアガロースゲル電気泳動で確認した (補 足図 3, 11, 18)。 合成した Dgel は、Amicon 3-kDa Mw cutoff microtubular centrifugal filter を用いて 2 回脱塩した。 走査型電子顕微鏡（SEM）撮影のため、FreeZone 凍結乾燥機（Labconco, Kansas City, MO, USA）で水分がなくなるまで凍結乾燥させた。 乾燥させた試料を割って、新鮮な表面を露出させた。 2〜3nmのPt層で100秒間スパッタコーティングした後、これらのヒドロゲル表面の形態を、S-3500N（日立、東京、日本）走査電子顕微鏡を用いて、加速電圧15kVで〜50，000倍で観察した（補足図19）
Iゲルの安定性試験
自由IプラスミドおよびIゲルのそれぞれについて7個の試料が準備された。 各サンプルにおいて、2μLのフリーIプラスミド（57 ng）またはIゲル（57 ngのIプラスミドを含む1:1500ゲル）を12μLの蒸留水で希釈し、4μLの転写最適化5×バッファーを加え、最終容量20μLに3.33 × 10-5 units of DNase I (No. M6101; Promega) で処理を行い、37℃でそれぞれ0、1、4、12、24及び48時間インキュベートした。 インキュベーション後、20 µLのサンプルを2つの10 µLアリコートに分離した。1つは電気泳動用、もう1つは次の転写用である。 それぞれのアリコートで、1 µLのRQ1 DNase stop solutionを加え、65℃で10分間インキュベートすることにより変性反応を停止させた。 その後、各サンプル10 µLを2 µLのゲルローディングバッファーと混合し、2%アガロースゲルを用いて100 V、60分間電気泳動した（補足図13）。 各サンプルの別のアリコートを、消化反応後の I-gel の転写効率を示すための転写反応に用いた。転写キット (Riboprobe; Promega) を用いて I-gel またはフリーの I-plasmid テンプレート (0, 24, 48 h) から shRNA をメーカーの説明に従って転写させた。 得られたshRNAは、Total RNA preparation and reverse transcriptionおよびReal-time PCR and data analysisの項（補足表4）に記載の通り、RT-qPCRにより定量した。
タンパク質の発現および阻害解析
共転写・翻訳キット（1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, カタログ番号88882）サーモフィッシャーサイエンティフィック（Waltham, MA, USA）から購入し、メーカーの提示する手順に従って反応させた。 簡単に言えば、HeLa細胞ライセート、アクセサリータンパク質、反応ミックス、およびpcDNA3.1( + ) IRES GFPプラスミド（0.5 μg/μL; No.51406; Addgene, Cambridge, MA, USA）を、12.5：2.5：5：2（v/v）の比率で混合し、30℃で1、2、4、6時間インキュベートした。示された反応時間の後、サンプル溶液を4℃で24時間インキュベートして反応を止め、十分なタンパク質フォールディング時間を確保した。 干渉効率を評価するために、1000 ngのGFPプラスミドの存在下で、遊離のIプラスミドまたはIゲルを細胞溶解液に添加した。 57 ngのI-プラスミド（17.5 nmol）、スクランブルshRNA（17.5 nmolおよび1.75 μmol；それぞれI-プラスミド量に対して1 eqおよび100 eq）（SN-1003；Bioneer、ソウル、韓国）を含む最適化Iゲル条件のコントロール実験において、スクランブルプラスミド混合物（17.5 nmol；スクランブルshRNA発現プラスミド混合物；Cosmo Genetech）、スクランブルプラスミドゲル（スクランブルプラスミド混合物をX-DNAで酵素的に架橋）、Iゲル成分（X-DNAのみ、I-プラスミドのみ、またはこれらの混合物で酵素的架橋なし；すなわち、ゲル形成なし）、またはブランクゲル（X-DNAのみの酵素的架橋）をGFP発現反応液中に直接添加した。 すべての反応は少なくとも3回行った。 特に断らない限り、反応液量は25μLに保った。 蛍光スペクトルは、分光蛍光光度計（FluoroMate FS-2; SCINCO Co, Ltd.）を使用して分析した。 1754>
Total RNA preparation and reverse transcription
スパイクインコントロールとして、RNA抽出前に、すべての前発現細胞溶解液（20 μL）に3 μLのcel-miR-39（33 fmol/μL; No.59000; Norgen Biotek Corp.、Thorold、 ON、 Canada）を加えた。 次に、TRIzol Reagent (Ambion, Thermo Fisher Scientific) を用いて、ライセート23 µLから製造者の指示に従いtotal RNAを抽出した。 抽出したtotal RNAを10μLのDEPC処理水（Ambion, Thermo Fisher Scientific）に溶解させた。 次に、2 µLのトータルRNAを、5 UのEscherichia coli poly(A) polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) を含む1 × poly(A) polymerase buffer中で1 mM ATPを用いて37℃で30分間、20 µL反応混合物でポリアデニル化した。 逆転写のために、4 µLの尾部RNAを1 pmolのRTプライマーおよび0.5 mM dNTP mixと混合し、DEPC処理した水で13 µLの容量にした。 この混合物を65℃で5分間加熱した後、氷上で急速に冷却した。 次に、反応混合物を、5 mM ジチオスレイトール、1 ×ファーストストランドバッファー、40 U RNase inhibitor、および200 U SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) を加えて最終容量20 μLとし、50℃で1時間インキュベートし、続いて70℃で15分間酵素不活性化させた。 RNA配列からcDNAを合成するために、RTプライマー配列（補足表5を参照）を設計した。 使用したプライマーは、FirstChoice RLM-RACE kit (Ambion, Thermo Fisher Scientific)に含まれる3′RACEアダプターであった。 プライマーは、cel-miR-39 forward primer（Norgen Biotek Corp.）を除き、すべてCosmo Genetech社で合成したものである。 各ライセート溶液中のRNAの回収率は、得られたスパイクインコントロールのCT値とリファレンスのcel-miR-39（抽出処理を進めていない）のCT値の差から推定した。
リアルタイムPCRとデータ解析
shRNAおよびGFP mRNAの量は、StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) を用いたqPCRにより定量化した。 各サンプルのqPCRは、cDNA2μL、2×Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）10μL、各プライマー10pmolの総容量20μLで実施した。 増幅は、95 ℃で10分間の初期変性、95 ℃ 15秒、60 ℃ 30秒、72 ℃ 30秒の30サイクルで行った。また、各サンプル中のトータルRNAの回収率を得るために、リファレンスRNAとしてセル-ミR-39を用いてqPCRを行った。 qPCRプロトコルは、使用したプライマーが共通のリバースプライマー（shRNAリバースプライマーと同じ）およびcel-miR-39フォワードプライマー10 pmolである以外は、本項で述べたものと同じであった。 qPCR終了後、60℃から95℃まで＋0.3℃/sの速度で昇温しながら、1サンプルあたり6回、SYBR Green色素の蛍光強度変化を測定し、各増幅DNA産物の融解曲線を求めた。 qPCRに用いる特異的なプライマーは、Primer3プログラム（http://primer3.ut.ee/）を用いて設計した（補足表5）。 標的の相対発現量は、比較2-ΔΔCT法を用いて決定した。 また、GFP mRNAの相対量は、2％アガロースゲルでのバンド強度測定により確認した。 cDNAの増幅は、PCRサイクル数（GFP mRNAは20）を除き、前述のqPCRに用いたものと同じPCR条件、プログラムで行った。
RNA絶対量の検量と定量
各RNA標準物質を用いて、RNA濃度およびCT値の標準曲線を求めた。 shRNAについては、Integrated DNA Technologies社から購入した合成shRNAを用いて標準曲線を求めた。 GFP mRNA については、転写キット（Riboprobe；Promega 社製）から抽出した GFP mRNA を用いて、製造者の指示に従い曲線を得た。 標準 shRNA の RNA 量は Integrated DNA Technologies 社から、抽出した標準 GFP mRNA の RNA 量は BioSpectrometer を用いて UV/Vis 吸収値から決定した。 得られた標準RNAは、上記「Total RNA調製と逆転写」の項と同様、逆転写によりcDNAに変換した。 その後、cDNAを10、100、1000、10000倍に希釈し、qPCRを3回繰り返し、得られたCT値から標準曲線を求めた。 RT-qPCR で得られた CT 値は、キャリブレーション処理により、細胞ライセート中の初期 RNA 濃度に換算した（補足図 6）。 各RNA回収率（％）と検量線からのRNA量の値を掛け合わせて、最終的なRNAの絶対量を求めた（補足表1、2）。
Cy5-I-gelによる細胞標識
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellはKorea Cell Line Bank (Seoul, Korea) から入手し、10%牛胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシン添加DMEMで湿潤、CO2 (5%) 管理のインキュベーター内で培養した。 GFP発現MDCK（MDCK-GFP）細胞は、Lipofectamine試薬（Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造者のプロトコルに従って、pEGFP-N1ベクターを細胞にトランスフェクトすることにより調製した。 その後、FACSCanto II system（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）を用いてGFP発光細胞のソーティングを行った。 研究期間中、細胞はマイコプラズマの汚染について陰性であることを検査で確認した。 カバースリップ付き24ウェルプレートで培養したMDCK-GFP細胞（各ウェルあたり50,000細胞）を、Cy5標識X01 DNA配列鎖（2.625 μM X-DNA; Integrated DNA Technologiesに相当）を含むCy5標識I-gel（Cy5標識I-ゲル）と無血清培地で4時間共存させた。 Cy5-Iプラスミドを調製するために、まず、Cy5-dsDNA（Cy5結合dsDNA）を、Cy5結合X01（5′p-GATC粘着端を追加した）とその相補的対鎖（5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′）をアニールすることによって調製した。 その後、Cy5-dsDNAとI-プラスミドをモル比5000：1で混合し、ライゲーションした。 余分な未結合Cy5-dsDNAは、Amicon社製マイクロチューブ遠心フィルター（50 kDa Mw cutoff）を用いた遠心分離（12400 g, 4℃, 60 min）により4-5回に分けて除去した。 Cy5-shRNA（Cy5-conjugated shRNA）は、市販のものを合成した（Integrated DNA Technologies）。 Cy5-I-plasmid および Cy5-shRNA セットでは、無血清培地中で細胞を各サンプル 2.625 nM と共培養した。Lipofectamine-Cy5-I-plasmid および Lipofectamine-Cy5-shRNA セットでは、Lipofectamine と Cy5-conjugated sample をモル比 1:1 で混ぜ合わせ、最終溶液濃度 2.625 μM Lipofectamine および 2.625 μM substrate に静電複合化させた。 その後、無血清培地中で2.625 μM Lipofectamine-Cy5-I-plasmid または Lipofectamine-Cy5-shRNA と細胞をそれぞれ4時間コンサベーションした。 細胞のみのコントロールの場合、1% (v/v) ペニシリン (HyClone) を含む無血清DMEMとコンサベーションした。 4時間の同時培養後、すべてのサンプルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）緩衝液（0.1M、pH7.4）で2回洗浄し、さらに10%（v/v）牛胎児血清（FBS; HyClone）および1%ペニシリンを含む増殖培地で6時間インキュベートして細胞の回復と取り込み時間を十分に確保した。 培養した細胞を4%ホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、さらにPBSバッファー（0.1M、pH7.4）で3回洗浄した。 顕微鏡撮影のために、付着した細胞のあるカバースリップを、退色防止剤を含む水性マウンティングメディウムを用いてスライドグラスにマウントした。 蛍光画像はZeiss Axioplan 2顕微鏡で記録し、写真はZeiss Axiocam HRカメラで撮影した。
I-gelを用いたGFP遺伝子封鎖実験
まず、262.5μM X-DNA と175 nM I-プラスミドを含むI-gelを300 UのT7 RNA polymerase(Thermo Fisher Scientific)とともに室温で15分インキュベートした。 インキュベーション後、I-ゲル試料を1%ペニシリンを含む無血清DMEMで100倍に希釈した。 I-プラスミド、スクランブルプラスミド混合物、スクランブルプラスミドゲルセットについては、I-ゲルの場合と同じモル量の各プラスミドとT7 RNAポリメラーゼでMDCK-GFP細胞を共培養し、24時間後にI-ゲルとポリメラーゼ複合体をカバースリップ付き24ウェルプレートの各ウェルへ添加した。 naked shRNA および Lipofectamine-shRNA の RNAi 効果の測定には、細胞溶解液実験から算出した I-gel の shRNA 発現率を考慮して、I-プラスミドテンプレート数に対して 100 倍の各 RNA サンプルを使用した。 naked shRNA と scrambled shRNA のセットでは、MDCK-GFP 細胞を 175 nM の RNA サンプルとコンサベーションした。 リポフェクタミン複合化サンプルは、製造元の説明書に従って調製した。 リポフェクタミン-I-プラスミドおよびリポフェクタミン・スクランブルプラスミド混合セットでは、リポフェクタミンと各プラスミド試料をモル比5：1で混合して静電的に複合化し、最終溶液濃度をリポフェクタミン 8.75 nMおよびプラスミド基質 1.75 nMとした。 Lipofectamine-shRNA セットでは、Lipofectamine と遊離 shRNA をモル比 5:1 で混合し、最終溶液濃度が 875 nM Lipofectamine および 175 nM shRNA となるように静電的に複合化させた。 MDCK-GFP 細胞と調製したリポフェクタミンを複合化したサンプルを無血清培地中で 4 時間インキュベートした。 4時間の同時培養期間後にすべてのサンプルを洗浄し、さらに細胞を増殖培地（10%（v/s）FBSおよび1%ペニシリンを含むDMEM）とともに48時間インキュベートし、5%CO2下の37℃でRNA-サイレンシング効果を評価した。 その後、細胞を4%ホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、PBSバッファー（0.1M、pH7.4）で洗浄した。 顕微鏡撮影のため、カバースリップで接着した細胞を、退色防止剤入りの水性マウント液を用いてスライドグラスにマウントした。
生細胞での定量PCRによる遺伝子発現解析
すべてのサンプルは、先に述べたI-gel部を用いたGFP遺伝子封鎖実験で用いたのと同量、同条件で各細胞培地に処理、インキュベーションを実施した。 培養後、細胞培養プレートから細胞培地を吸引し、PBSバッファーでMDCK-GFP細胞を1回洗浄し、トリプシン処理によりプレートの各ウェル内の細胞を剥離した。 剥離した細胞をPBSバッファで希釈してトリプシンを失活させた後、1.5 mLマイクロチューブに回収し、遠心分離（180 g、5分）によりペレット化した。 上清を除去し、細胞を20 µLのPBSバッファーで希釈した。 細胞懸濁液（20 µL）をTRIzol Reagent 1 mL、cel-miR-39（33 fmol/µL）3 µL、クロロホルム溶液200 µLで処理した。 その後のRNA抽出は、製造元の説明書に従って行った。 細胞レベルでのGFP mRNAとshRNAの相対量を定量するために、サンプル調製物のすべてのqPCRは、「Total RNA調製と逆転写」及び「リアルタイムPCRとデータ解析」の項に記載したのと同様の方法で行った。
ピクセル強度定量用の細胞画像解析
細胞画像の処理により、データはMATLAB（The MatWorks, Inc, Beltsville, MD, USA）プログラムにより実施された。 生の蛍光画像をMATLABに取り込み、画像中の各画素を行列の各成分に変換した。 各成分の蛍光強度の分布はヒストグラムでグラフ化した。
蛍光活性化セルソーティング解析
細胞培養プレートから増殖培地を吸引し、1mLのPBSで1回洗浄した後、細胞培養プレートから増殖培地を吸引した。 その後、トリプシン処理により細胞をプレートから剥離した。 剥離した細胞は15mLチューブに集め、遠心分離してペレットを得た(180 g, 3 min)。 上清のトリプシン溶液を除去し、細胞ペレットを2mLのPBSで2回洗浄した。 細胞は50,000cells/mLとなるようにPBSに再懸濁した。 その後、1%ホルムアルデヒド溶液で室温にて10分間固定し、サンプルを調製した。 FACSCanto II system（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）を用いてGFP蛍光強度を解析した。
暗条件での相対生存率
MDCK-GFP細胞懸濁液（5000 cells per well）を96wellプレート（コーニング社、コーニング、ニューヨーク、アメリカ）に分注し、37℃、5％CO2下で1日間インキュベートした。 細胞がプレートに付着した後、暗所にて増殖培地（10% (v/v) FBSと1% penicillinを含むDMEM）中で異なる濃度のI-gel（X-DNA濃度に対応）と共培養した。 I-ゲルは、X-DNA：I-プラスミドのモル比が1500：1となるように構成した。 これらの試料を5% CO2下、37℃で6、24、48時間インキュベートした。 各インキュベーション時間の終わりに、Cell Counting Kit-8 solution (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) を、製造者の指示に従ってサンプルに添加した。 さらに1時間インキュベートした後、450 nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。 この測定結果は、サンプルの吸光度と、サンプルをインキュベートしていない陰性対照細胞の吸光度との比として表した。
統計解析
統計解析は、Prism 7.05 software (GraphPad Software) でStudentのt検定、ボンフェローニ多重比較後検定による一元配置分散分析で行った。 ホルム・ボンフェローニ多重比較ポスト検定は、Prism 7.05 software (GraphPad Software)30によるボンフェローニ多重比較ポスト検定結果を用いて実施した。 正規性検定は Shapiro-Wilk 検定により算出した。 Shapiro-Wilk検定の結果、Dataはほぼ正規分布であった。 統計的有意性は、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
と表示した。