Results
ABT-263 は口腔内で利用できる Bcl-2 ファミリー阻害剤であり、Bcl-2 ファミリーを阻害する。 ABT-737の望ましくない薬物特性を与える構造的特徴は、大きな表面積、疎水性タンパク質-タンパク質相互作用、および血清アルブミン結合の減少の阻害に不可欠な設計要素に起因する（4-6）。 この比較的大きな分子（分子量>800）の経口薬効を改善するためには、標的親和性、細胞効力、経口吸収性の間で慎重なバランスが必要であった。 ABT-737の骨格に沿って、電荷バランス、代謝、経口吸収に影響を与える3つの重要な部位が同定された（図1）。 これらの部位に修飾を加えた類似化合物は、動物における経口曝露量とヒト腫瘍細胞株における有効性との間の薬物動態学的／薬力学的関係を最大化するように最適化された。 これらの努力の結果、ABT-263.
ABT-737（左）とABT-263（右）の化学構造。
ABT-263 はBcl-xL、Bcl-2、Bcl-wに対して高い親和性を維持しており、蛍光偏光アッセイの検出限界以下（Ki ≦1 nmol/L）だが、Mcl-1とA1にはより弱く結合した（表1）。 この選択性パターンは，前任のABT-737やBH3のみのタンパク質であるBadと同様である(12)． ABT-263のBcl-xLに対するサブナノモル親和性は，より感度の高い時間分解蛍光共鳴エネルギー移動測定法によって確認され，エナンチオマー（モルホリノエチル基の配置が反対の立体異性体で，低活性のコントロールとして使用）は約40倍低い活性を持つことが示された．
- View inline
- View popup
Bcl-2ファミリータンパク質への結合親和性
ABT-263の薬物動態プロファイルは、マウス、ラット、イヌおよびサルにおいて低い血漿クリアランス値および低い分布容積によって特徴づけられ、静脈内投与後の血漿消失半減期は4.6時間から8.4時間となります（補足表S1）。 また，経口投与によるバイオアベイラビリティは4種とも20％程度であった。 ABT-263は水溶性が低いため、溶解速度に制限された経口吸収が長く続く。 この化合物の溶解度が著しく高い脂質ベースの製剤でP.o.投与すると、吸収が促進され、イヌではバイオアベイラビリティが50%近くになり、経口排泄半減期は8.9時間であることが分かった。 1211>
ABT-263 は、メカニズムに基づいた細胞毒性を示します。 多くのBH3模倣小分子がBcl-2ファミリーメンバーと適度な親和性で結合し、腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導することが報告されている(21-23)。 しかし、これらの薬剤の多くは、Bax/Bak非依存的に細胞を殺すことが最近示され、Bcl-2タンパク質に対する弱い親和性の機能的関連性とこれらの分子の真の作用メカニズムに疑問を投げかけている(14)。 したがって、ABT-263によって誘導されるアポトーシスがBcl-2ファミリータンパク質の阻害の直接的な結果であることをしっかりと証明することが重要であると考えた。 まず、インターロイキン-3（IL-3）依存性の前リンパ球系マウス細胞株FL5.12で、ABT-263の細胞活性を評価した。 IL-3の脱落は、部分的にはプロアポトーシス因子であるBimとPumaのアップレギュレーションによって、FL5.12のアポトーシスを誘導する（24、25）。 Bcl-2 (FL5.12-Bcl-2) または Bcl-xL (FL5.12-Bcl-xL) の過剰発現は、Bim と Puma の隔離により IL-3 休止の影響から保護される (25)． ABT-263は、エナンチオマーではなく、Bcl-2またはBcl-xLの過剰発現による保護を逆転させた（それぞれEC50 = 60および20 nmol/L；図2A）。 ABT-263は、FL5.12細胞がアポトーシス促進刺激を受けないIL-3存在下では、細胞死を誘発するのに有効であった。 ABT-263がIL-3遮断下でFL5.12-Bcl-2またはFL5.12-Bcl-xL細胞を殺す能力は、カスパーゼ阻害剤ZVADの存在下で著しく減衰し、細胞死がカスパーゼ依存性であることを示した（補足図S2）
ABT-263による抗アポトーシスBcl-2ファミリータンパク質の阻害は、ミトコンドリア依存性アポトーシスを誘導する。 A、Bcl-xLまたはBcl-2を過剰発現させたFL5.12細胞におけるIL-3依存性の回復。 細胞±IL-3を0〜1,000 nmol/LのABT-263またはエナンチオマーコントロールで処理し、CellTiter Gloで生存率を評価した。 点、平均値（n = 3）、バー、SD。 B、HeLa細胞における哺乳類ツーハイブリッドシステムで評価したBcl-xL/Bcl-xS相互作用の破壊。 細胞は0〜500nmol/LのABT-263（閉じた列）またはエナンチオマー（開いた列）で処理され、破壊はBrightGloで評価された。 列は平均値（n = 3）、棒はSD。 C、H146細胞におけるBcl-2およびBcl-xLの阻害に伴うBaxの活性化およびシトクロムc（Cyto c）の放出。i、種々の濃度のABT-263またはエナンチオマーによる処理後2時間で単離された細胞質画分におけるBaxおよびシトクロムcの免疫ブロット。i、抗活性化Bax（赤）および抗シトクロムc（緑）抗体による細胞の免疫組織化学的染色。 D、H146細胞において195 nmol/L ABT-263（閉じた列）または195 nmol/L エナンチオマー（開いた列）によって誘発されたカスパーゼ-3の時間依存性および用量依存性活性化。 コラム、平均（n = 3）；バー、SD。 R.U.、相対単位。
ABT-263による細胞毒性が、細胞内のBcl-2ファミリータンパク質-タンパク質相互作用の破壊に起因しうるかどうかを決定するために、共免疫沈降試験が行われた。 ABT-263はFL5.12-Bcl-xL細胞において、処理後2時間以内にBim：Bcl-xL相互作用の用量依存的な減少を誘導した（補足図S3）。 同様のパターンは、FL5.12-Bcl-2細胞におけるBim：Bcl-2複合体の破壊についても観察され（データは示さず）、ABT-263が、Bcl-xLおよびBcl-2がBimなどのプロアポトーシス因子を隔離する能力を減弱することによってIL-3依存性の細胞死を回復することが示されている。 ABT-263がBcl-2ファミリータンパク質-タンパク質相互作用を破壊する能力は、哺乳類ツーハイブリッドシステムで確認された（図2B）。 ABT-263は、VP16-Bcl-xSとGal4-Bcl-xLの相互作用を阻害し（見かけのEC50〜50 nmol/L）、一方、エナンチオマーはあまり効果がなかった。
さらに作用メカニズムを調べるために、野生型（WT）とBcl-x、Mcl-1、Bax/Bak欠損（DKO）を含む一連のマウス胚線維芽細胞（MEF）でABT-263の活性が評価された。 ABT-263は、Mcl-1-/-（EC50〜50 nmol/L）において細胞死を誘発したが、Bcl-x-/-（EC50≧10 μmol/L）のMEF細胞では誘発しなかった（補図S4A）。 これは、ABT-263が細胞内でMcl-1ではなくBcl-xLを機能的に阻害する能力を有することを確認し、ABT-737を用いた以前の観察結果と一致する（7、11、13、14、26）。 このエナンチオマーは両系統で効果がなかった。 ABT-263は、WTまたはDKO MEF細胞のいずれに対しても殺傷効果がなく（EC50≧10μmol/L）、以前の報告と一致していた（14）。 一方、一般的な細胞毒性物質であるエトポシド、および2種類の低分子BH3模倣物質は、4種類のMEF細胞すべてにおいて同様のEC50で細胞死を誘導したことから、これらの化合物は、少なくとも部分的には、Bcl-2ファミリー非依存のメカニズムによって細胞死を誘導していると考えられる（補足図）。 ABT-263がヒト腫瘍細胞株においてアポトーシスを直接誘導する能力を評価するために、SCLC細胞株H146においてBax転位およびチトクロムcの放出をモニターした。 H146は、生存のためにBcl-2に依存していることが示されている（25）。 ABT-263は、処理後2時間以内に細胞質Baxの用量依存的な減少と細胞質シトクロムcの増加を引き起こした（図2C-i）。 エナンチオマーは、同様の反応を引き起こすことができなかった。 Baxの活性化とシトクロムcの放出は顕微鏡で確認した(Fig. 2C-ii)。 Baxのコンフォメーション活性型を特異的に認識する6A7抗Bax抗体を用いて、H146細胞における活性化Baxを検出した。 分画研究と一致して、ABT-263処理は活性化Baxの大幅な増加と関連していた。 これは、点状構造の減少と細胞質染色の増加によって証明されるように、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロムcの放出に対応するものであった。 ABT-263は、そのエナンチオマーではなく、カスパーゼ-3活性の時間依存的な増加も誘導した。この活性は2時間で検出され、約6時間でピークに達した（図2D）。 この効果は濃度依存的であり、6時間後のEC50は約100 nmol/Lであった（図2D、挿入図）。 一方、トポイソメラーゼI阻害剤であるカンプトテシンは、ミトコンドリアアポトーシスとそれに続くカスパーゼ活性化を誘発することが報告されているが（27、28）、24時間後にのみカスパーゼ3活性の増加を引き起こすことができた（データは示されていない）。 これらのデータは、ABT-263がBcl-2およびBcl-xLを阻害するために直接作用し、Bimなどのプロアポトーシス因子を遊離して、ミトコンドリアアポトーシス経路の急速な活性化を誘導することを示している。 ABT-737に関する以前の報告（12）と一致して、ABT-263はSCLCと血液悪性腫瘍で単剤活性を示したが、他の腫瘍型の大部分では示さなかった（データは示されていない）。 これらの感受性の高い腫瘍型内での活性をより詳細に調べるため、ABT-263はSCLC（n＝22）および血液学的悪性腫瘍（n＝23）由来の細胞株のパネルで検討された。 各パネルにおいて、ABT-263はさまざまな効力を示し、32％（SCLC）と48％（血液腫瘍）の細胞株が高い感受性を示した（EC50 <1 μmol/L、図3）。 エナンチオマーはこれらの感受性細胞において>20倍低い活性を示した（補足表S2）
ABT-263 のin vitroでの細胞活性。 10％ヒト血清の存在下、SCLC（左）または白血病／リンパ腫（右）のヒト腫瘍細胞株のパネルに対するABT-263（閉じた列）またはエナンチオマー（開いた列）のEC50値。 コラム、平均（n≧3）；バー、SD。＜1211＞＜8283＞＜4969＞ABT-263の経口投与は、in vivoでSCLCおよびALL異種移植片腫瘍の退縮につながる。 これらの観察をin vivoで拡張するために、ABT-263は、いくつかの感受性のあるSCLCおよび血液細胞株から確立された脇腹異種移植モデルで評価された。 ABT-263は、1日1回100 mg/kgを21日間連続投与すると、H889（SCLC）またはRS4；11（ALL）腫瘍を持つすべての動物で治療終了後数週間持続する迅速かつ完全な腫瘍応答（CR）を誘導した（図4A）。 H146 SCLC腫瘍を持つマウスに同様の治療を行ったところ、60%の動物でCR、40%の動物でPRとなり、急速な退縮が見られた（図4A）。 このモデルでは、投与終了後数週間から徐々に腫瘍のリバウンドが観察された。 H146異種移植モデルにおいて、活性は用量依存的であった。 ABT-263を50mg/kgで21日間連続投与すると、22％の動物にCRが、44％の動物にPRが認められた。一方、25mg/kgでは統計的に有意だが緩やかな腫瘍増殖抑制が認められ、腫瘍の退縮は観察されなかった。 ABT-263は、すべての用量で忍容性が高かった（<5%の体重減少）
ABT-263のin vivo活性。 Wilcoxon順位和検定で決定したビヒクル対照と比較した腫瘍成長の有意な阻害（P < 0.05）。 Mantle-Cox log-rank検定で決定した腫瘍増殖遅延（1mm3腫瘍エンドポイントまでの中央値）の有意な改善；P < 0.001。 A、ABT-263はSCLCとALLの異種移植モデルにおいて高い有効性を示す。 左、H889。 閉じた四角はABT-263を1日1回21日間経口投与したもの、開いた四角はビヒクル。 中、H146、ABT-263の用量反応。 閉じた円、100mg/kg/d；閉じた三角形、50mg/kg/d；閉じた菱形、25mg/kg/d；開いた正方形、ビヒクル。 右は、RS4;11。 閉じた四角、ABT-263を1日1回21日間p.o.で投与；開いた四角、ビヒクル。 B：ABT-263と他剤との併用。 左：DoH2 B細胞リンパ腫異種移植モデル。 閉じた円はビヒクルの併用、閉じた三角はABT-263の100mg/kg、p.o.、qd×17、開いた菱形はリツキシマブの10mg/kg、i.v.、qd×1、閉じた四角はABT-263＋リツキシマブの併用である。 中段、GRANTA-519マントル細胞リンパ腫異種移植モデル。 閉じた円、組み合わせビヒクル；閉じた三角形、ABT-263、100mg／kg、p.o.、qd×21；開いたダイヤモンド、R-CHOP（リツキシマブ、10mg／kg、i.v、qd×1；サイクロホスファミド、25mg／kg、i.p。 ドキソルビシン 3 mg/kg, i.v., qd x 1; ビンクリスチン 0.25 mg/kg, i.v., qd x 1; プレドニゾン 0.5 mg/kg, p.o., qd x 1）、閉じ角は ABT-263 + R-CHOP です。 右、OPM-2多発性骨髄腫異種移植モデル。 閉じた円は併用ビヒクル；閉じた三角は ABT-263 100mg/kg, p.o., qd ×21；開いた菱形はボルテゾミブ 1mg/kg, i.v.., ABT-263の曝露量と抗腫瘍効果を関連付けるため、非腫瘍性マウスに1日1回3日間p.o.投与し、3回目の投与後に血漿中薬物濃度を測定する定常状態の薬物動態試験が行われた。 血漿中ピーク濃度（Cmax）および血漿中濃度曲線下面積（AUC）はいずれも投与量に比例し、ほぼ直線的に増加した（Supplement Table S3）。 全奏功率（全奏功率＝CR＋PR）100％となる100 mg/kg投与時のCmaxおよびAUCはそれぞれ7.7 μmol/L，90 μmol/L hであった。 また，全奏功率66％を示した50 mg/kg投与時の曝露量は5.4 μmol/L（Cmax）および54 μmol/L h（AUC）であった。 これらのデータは、ABT-263の血漿中ピーク薬物濃度が約5.4から7.7μmol/Lであることが、高い効果をもたらすことを示しています。
ABT-263 は生体内の化学療法剤の活性を増強する。 ABT-263のin vivoでの有効性は、血液学的悪性腫瘍のいくつかの攻撃的なモデルにおいて、一般的に使用されている治療薬との併用で調査されました。 ABT-263とリツキシマブは、DoH2 B細胞リンパ腫脇腹異種移植モデルで検討された（図4B）。 ABT-263は、100mg/kg p.o.を毎日17日間投与したところ、44％の腫瘍増殖抑制効果を示した。 リツキシマブの10mg/kg単回投与では、84％の腫瘍増殖抑制効果を示した。 ABT-263とリツキシマブ単独では持続的な腫瘍退縮は得られなかったが、併用により優れた効果を示し、CR70％、PR10％を達成した。 1211>
マントル細胞リンパ腫のGRANTA-519脇腹異種移植モデルにおいて、ABT-263単独および修正R-CHOPレジメンとの併用の有効性も評価された（図4B）。 ABT-263を100mg/kg p.o.で21日間連続投与したところ、40％の腫瘍増殖抑制が認められた。 一方、R-CHOP療法では、腫瘍の成長を68％抑制し、20％のCRを達成しました。 この併用療法は、試験したすべての動物で劇的な腫瘍の後退と完全な腫瘍反応をもたらし、評価可能な9つの腫瘍のうち4つでは腫瘍の再増殖の証拠がなかった
最後に、ABT-263に耐性のあるモデルで化学療法の効果を増強する能力を調べた。 多発性骨髄腫のOPM-2脇腹異種移植モデル（in vitro EC50 = 6.7 μmol/L）では、ABT-263を100 mg/kgで21日間毎日投与しても、腫瘍増殖は有意に阻害されなかった（図4B）。 ボルテゾミブを最大耐量（1 mg/kg i.v.、qd×3）で投与すると、腫瘍の成長が 70％阻害され、CR は認められな かった。 ABT-263はボルテゾミブの効果を高め、併用により95％の腫瘍増殖抑制と40％のCR率を達成しました。 我々は最近、ABT-737が骨髄毒性なしに、Bcl-2ファミリータンパク質の阻害と循環血小板のアポトーシス誘導の結果として、動物において迅速かつ可逆的な血小板減少を引き起こすことを報告した(29)。 予想通り、ABT-263も血小板減少を誘導する。 イヌに単回p.o.投与後、循環血小板数は2時間以内に減少し、6時間後に血小板数はゼロになり、24時間以内にリバウンドが見られた（Fig. 5A）。 長期投与の影響を調べるため、イヌに1日複数回投与した場合の薬物動態／薬力学的関係を調べた（Fig.） ABT-263を2 mg/kg/dで6日間経口投与し、その後6 mg/kg/dに増量してさらに6日間投与した。 血小板数および血漿中薬物濃度は、1～4日目および7～11日目の血小板直下点を捉えるため、治療後6時間目に評価された。 血小板数は2 mg/kg投与時に初期値約25万/μLから2回目には約12万5千/μLに減少し，その後は安定した血小板数を維持した。 投与6時間後（C6h）の血漿中薬物濃度は3.6～4.2 μmol/Lで一定であった。 ABT-263の薬物動態プロファイル（補足図S1）から，C6hはCmaxの約2倍であり，2 mg/kgの反復投与で得られる血漿中薬物濃度のピークは約7～8 μmol/Lであることが示唆された。 この値は、マウスに100 mg/kgをp.o.投与したときの値とほぼ同じである。 ABT-263の用量を6 mg/kg/dに増加させた場合、血小板数はこの高用量の2日目までに約50,000/μLに減少し、試験の期間中は比較的一定であった。 この用量でのC6h値は10.2～14.8μmol/L（Cmax、20～30μmol/L）であった。 ABT-263はこの試験において、死亡率や有害な臨床症状はなく、忍容性は良好であった。 しかし、静脈穿刺部位にいくつかの血腫が認められ、止血の変化と一致した。 これらのデータは、マウスモデルで高い有効性が示されているレベルのABT-263を毎日繰り返し投与すると、イヌの循環血小板が約50％減少することを示している。 さらに、有効性の数倍高い血漿中濃度でも耐容性があり、循環血小板数は約50,000/μLに減少しました。
イヌの循環血小板に対するABT-263の効果。 A、イヌにおけるABT-263（5mg/kg）の単回p.o.投与後の循環血小板数レベル。 列は平均値（n = 3）、棒はSE。 B、イヌにおける1日複数回投与（2mg/kg、1〜6日目；6mg/kg、7〜11日目）後の血小板数およびABT-263血漿中濃度。 閉じた四角、ABT-263血漿中濃度、開いた円、1〜4日目および7〜11日目の血小板数。 点：平均値（n = 3）、棒：SD