Assembly Principles Learned from In Vitro Studies
細菌の機能性30Sおよび50Sリボソームサブユニットは、rRNAとそれぞれのリボソーム蛋白質から試験管内で再構成することが可能である。 in vitroにおけるリボソーム組み立ての基礎となる生化学的および生物物理学的原理の詳細な研究は、in vivoにおけるリボソーム生合成の調査の指針となる有用なパラダイムを提供している。
これらの実験によって明らかになった最初の原理の1つは、リボソームサブユニットへのrタンパク質の組み立てが階層的に行われるというものであった。 バクテリアの30Sリボソームサブユニットの再構成研究により、各rタンパク質とrRNAの結合順序を示す「アセンブリマップ」が定義された。 rタンパク質は、その結合順序に基づき、一次タンパク質（rRNAに直接結合）、二次タンパク質（一次結合タンパク質に依存して結合）、三次タンパク質（二次結合タンパク質に依存して結合）と分類される。 このような依存性マップは非常に有用な出発点であることが証明されているが、タンパク質結合の動力学に関する情報は得られない。 むしろ、組み立ての経路は、各rタンパク質がrRNAと最も安定に結合する順番を大きく反映しているのかもしれない。 さらに、このアセンブリマップでは、rタンパク質とは無関係の16S rRNAのフォールディング経路や、生体内で起こるrRNA前駆体の核分解処理がリボソームのアセンブリに果たす役割も考慮されていません。 最近では、化学的手法やヒドロキシルラジカルを用いたRNAコンフォメーション測定によるrRNPコンフォメーションの経時変化や、PC/MSを用いたrタンパク質とrRNAの結合速度の測定により、30Sサブユニット集合のこれらの側面がより詳細に研究されるようになっている。
アセンブリマップにおける一次結合r-proteinの観察についての可能な説明は、その結合部位が少なくとも部分的にはr-proteinとは無関係に16S rRNAが採用するコンフォメーションによって作られるということである。 実際、この考えやリボソームがRNA触媒から進化したという見解と一致して、16S rRNAの5’ドメインはすべてのrタンパク質がない状態でも折りたたまれて3次構造を形成できることが示されている。 この3次構造は、タンパク質が存在しない状態では完全には安定ではなく、したがって、rRNAが折り畳みを受ける際に採用する一時的なコンフォメーションによって生じる部位へのrタンパク質の結合によって安定化されている可能性が最も高いと思われる。
細菌のリボソームに関するin vitroの研究から明らかになった第三の原則は、リボソームの組み立てが進むにつれてrRNAとrタンパク質の結合が強化されることである。 多くのr-proteinはrRNA上の複数のヌクレオチドに接触している。 このことは、リボソームの生合成が進むにつれて、rタンパク質がrRNAとより多く接触するようになり、それによってリボソームとより安定的に統合されることを示唆している。
rタンパク質とrRNAの間に最初にいくつかの接触が確立すると、特定のRNA構造が安定し、rRNA構造の変化を誘導して追加の（第二、第三）rタンパク質に結合場所を提供できるようになることが考えられます。 したがって、r-proteinの結合は、RNAのフォールディングの利点を強化し、アセンブリプロセスに方向性を与えることになる。 このことから、RNAの構造変化とタンパク質の結合が交互に繰り返されることにより、最終的なRNAの構造が安定化され、組み立てが進むというモデルが考えられます。 キネティックデータから、成熟した30Sサブユニットの組み立ては、複数の並行したRNAフォールディング経路を経て行われ、そのすべてが最終生成物に収束することが明らかになった。 このことから、リボソームサブユニットの組み立てが行われる固有の経路とは対照的に、組み立ての風景という概念が生まれた
最終的に、in vitro 研究により、リボソームの組み立ては 5’から 3’の方向で行われることが明らかになった。 rRNAの二次構造のPC/MSおよび化学的プロービングにより、rRNAの3’ドメインにタンパク質が接触する前に、rRNAの5’ドメインへのrタンパク質の結合が観察されることが示されている。 一方、ヒドロキシルラジカルのフットプリントアッセイでは、16S rRNAに沿ってヌクレオチドが保護されることが示された。これは、RNAの折り畳みがRNA全体に広がる多くの異なる部位から核生成され、組み立てにおいて5’から3’への方向性がないことを示唆するものである。 これらの相反する観察は、異なる実験装置の特性を考慮することで調和させることができる。 PC/MSはタンパク質とrRNAの結合速度を測定するため、安定したrタンパク質とrRNAの相互作用のみを検出することができます。 一方、フットプリンティングアッセイでは、弱く結合したr-タンパク質と安定に結合したr-タンパク質の両方によるヌクレオチド保護を捉えることができる。 これらのデータを総合すると、リボソームの組み立ては rRNA 全体で核形成することができるが、rタンパク質と rRNA の最終的な緊密な結合は 5′ から 3′ 方向で起こることが示されている。 例えば、生体内でリボソームの組み立てが行われるとき、それはrRNAの転写と連動しており、これもおそらく観察されたrタンパク質結合の5’から3’への方向性に寄与している。rRNAは、合成されるときに5’から3’に折り畳まれ、そのようにrタンパク質を組み込むように進化し、組み立てとrRNAの転写を連動させているのかもしれない。 さらに、in vitroでリボソームサブユニットを再構成する際に加熱工程が必要であることや、リボソームの生成に欠陥のある多くの細菌変異体が同定されていることから、in vivoでのリボソーム生合成時にトランス作用因子が必要であることが示唆された
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