食物アレルギー診断のゴールドスタンダードはoral food challenge (OFC)です。 しかし、OFCは原因と思われる食品を摂取する必要があり、急性アレルギー反応を引き起こす可能性があり、重篤化する可能性があります。 このため、OFCは、アレルギー反応やアナフィラキシーを治療するための設備と専門知識を備えた、監視された環境で実施される必要があります。 OFCはかなりのリスクを伴うため、患者さんやご両親、そして臨床スタッフにも大きな不安を与える可能性があります。 したがって、可能な限り、食物アレルギーの診断は、原因となる食物に対するIgE介在性アレルギー反応の最近の納得できる病歴と、同じ食物に対する皮膚プリックテスト（SPT）および／または血清特異的IgE（sIgE）によるIgE感作の証拠によって確定される。 OFC は、SPT および/または sIgE の結果が不明確な場合に使用されます。 食物アレルギーや食物感作の認知度や普及率の上昇に伴い、より多くの患者が食物アレルギーの検査を受けるようになってきている。 アレルギー反応を引き起こした、あるいは臨床症状を伴わない、アレルゲン食物への経口曝露歴がない場合、SPTおよびsIgEの結果の解釈は特に困難となります。 特定のアレルゲン食品を摂取したことのない乳幼児は、アレルギー科を受診する患者のかなりの割合を占め、アレルギー状態を明らかにするためにOFCを必要とすることが多い。 その結果、OFCの実施に対する需要が高まっている。 アレルギー科ではこの需要に応えることが難しく、患者はOFCによる食物アレルギーまたは食物耐性の正確な診断を受けるまでに数ヶ月待たされることがある。これは不必要な食事制限や診断の不確実性に伴う大きな不安につながる可能性がある。 OFCはまた、食物アレルギーの消失の評価、閾値の決定、食物アレルギーの免疫調節治療に対する臨床反応のモニタリングのためのゴールドスタンダードでもあります。 2641>
BATは機能的な測定法であるため、単にアレルゲン特異的IgEの存在を検出するアレルギー検査よりも患者の臨床表現型に近い可能性を持っている。 簡単に言えば、BATは試験管内のOFCと見ることができ、食物を口から与える代わりに、急性アレルギー反応に関与する好塩基球を試験管内の食物抽出物に暴露する。 この類似性にもかかわらず、この2つの手順とその臨床応用の違いは指摘でき、ここに、BATがゴールドスタンダードOFCを忠実に模倣できるかどうか、すなわち、BATがOFC陽性時に生体内で起こるアレルギー反応を試験管内で再現できるのかという疑問が生じます。
好塩基球活性化試験
BATはフローサイトメトリーに基づく試験で、アレルゲン刺激後の好塩基球表面での活性化マーカーの発現を測定する – 図1. 好塩基球活性化試験陽性は、in vivoでの急性アレルギー反応のin vitroでの代用とみなすことができる。 ヒメバチ毒にアレルギーのある患者の研究では、好塩基球活性化マーカーのアップレギュレーションが、in vitroではイエロージャケットまたはミツバチ毒で刺激した後に、ex vivoでは刺傷陽性チャレンジの後に観察された。 この研究では、臨床症状（全身反応か局所反応か）とBATの結果がほぼ一致しており、BATがアナフィラキシーのバイオマーカーとなる可能性が示唆されています。 また、食物アレルギー患者においても、BATの結果とOFCの結果との間に良好な一致が認められた。 赤肉に対する遅延型即時型アレルギー反応を示すα-galアレルギー患者において、異なる時点で採取した血液中のex vivo好塩基球の活性化は、OFC中のin vivo全身性アレルギー反応の発現と一致した。 本研究の結果は、食物によるIgE介在性アレルギー反応とアナフィラキシーにおける好塩基球の役割を補強した。
親水性活性試験実験手順説明図。 アレルゲンまたはコントロールで血球を刺激した後、血球を蛍光色素と結合した抗体で染色し、フローサイトメーターを用いて細胞の識別と活性化マーカーの発現の測定を可能にする
異なる細胞表面マーカーを使用して全血中の好塩基球を識別することができ、IgE、CD123（HLA-DRと）、CCR3またはCRTH2（CD3と）またはCD203c …が挙げられる。
末梢血では、IgEは好塩基球、樹状細胞、好酸球、単球、マクロファージ、B細胞、血小板に検出され、好塩基球に特異的なものではありません。 CD123 は、IL-3 受容体の低親和性（α）サブユニットです。 形質細胞様樹状細胞と好塩基球に高レベルで、単球、好酸球、骨髄性樹状細胞および血液前駆細胞のサブセットに低レベルで発現しています。 HLA-DRによる追加染色は、HLA-DR陰性の好塩基球とHLA-DR陽性の樹状細胞および単球を区別する。 CCR3はC-C型ケモカイン（例：eotaxin、MCP、RANTES）の受容体で、好塩基球や好酸球に高発現しているが、Th1細胞やTh2細胞にも発現している。 CRTH2は、好塩基球、好酸球、T細胞に発現する別のマーカーであり、したがってCCR3と同様に好塩基球とT細胞を区別するためにCD3のようなT細胞マーカーを必要とします。 CD203cは好塩基球に恒常的に特異的に発現しているため、単独の識別マーカーとして、あるいは他のマーカーと組み合わせて使用できる。
アレルゲンによる刺激後、好塩基球表面ではCD63とCD203cという異なるタンパク質の発現が亢進している。 CD63はライソゾーム関連膜タンパク質（LAMP）で、安静時の好塩基球の表面には発現しておらず、細胞内の顆粒膜にのみ発現している。 顆粒が脱顆粒の際に好塩基球の形質膜と融合すると、CD63は好塩基球の表面に発現するようになる . CD203cは、ホスホジエステル結合とホスホスルフェート結合を切断する酵素で、オリゴヌクレオチドの3-ヒドロキシ末端から5-ヌクレオチドを順次加水分解的に除去する。 好塩基球やマスト細胞の表面に低レベルで独占的に構成的に発現し、細胞の活性化に伴い発現が増加する。 好塩基球の活性化マーカーは、CD63、CD107a、CD107bを含むものと、CD203c、CD13、CD164を含むものの2つの異なるグループを形成し、同時に発現が上昇するようである。 CD63とCD203cは最もよく使われる好塩基球活性化マーカーである。
BATの検査手順は、細胞刺激、細胞染色、フローサイトメトリーの3段階からなる。 好塩基球は時間の経過とともに生存率や反応性が低下するため、採血後できるだけ早く処理する必要がある。 しかし、4℃で24時間まで保存した試料を用いた研究も行われている。 BATには少量の血液（条件数により1-2 ml程度）が必要である。 細胞刺激には粗アレルゲン抽出物、精製アレルゲン、リコンビナントアレルゲンを使用することができる。 BATの結果は、活性化マーカーを発現する好塩基球の割合、あるいは刺激指数、すなわち選択した条件のMFIと陰性対照のMFIとの比を計算した平均蛍光強度（MFI）で決定することができる。 CD63は安静時では発現せず、活性化後の発現が二峰性であることから、通常CD63には前者が使用される。 後者は、安静時細胞で既に発現しており、アレルゲン刺激後の増加が単峰性であるCD203cについて通常用いられる-図2.
異なる条件で好塩基球表面のCD63およびCD203cの発現を示すドットプロット図およびヒストグラムである。 非刺激細胞（ネガティブコントロール）及びピーナッツ又は抗IgEで刺激した細胞（ポジティブコントロール）が表されている。 CD63の発現は陽性好塩基球の割合として測定し（左図）、CD203cの発現は刺激指数（SI）、すなわち アレルギー患者において、アレルゲンによる好塩基球の活性化は、一般にベル型の用量反応曲線を示し、アレルゲン濃度の増加（通常5-6 log差）により、プラトーに達するまで好塩基球活性化マーカーの発現が徐々に増加する-Fig. 3.
Basophil reactivity and basophil sensitivity.アレルゲンの濃度を上げると、好塩基球の活性化マーカーの発現はプラトーに達するまで徐々に増加する。 2人の異なる患者からの様々な濃度のアレルゲンで刺激した後の好塩基球活性化の用量反応曲線の2つの例を表している。 CD63+陽性細胞の割合は好塩基球反応性の指標であり、最大活性化の50 %における有効濃度であるEC50は好塩基球感受性の指標である
個人間のアレルゲンに対する好塩基球反応には大きなバラツキがある。 この不均一性を表現し、異なる患者間の好塩基球反応を比較するために、CD-maxやEC50（50 % effective concentration）あるいはCDsensなど、用量反応曲線に基づいて様々なパラメータを決定することができる。 CD-maxは最大活性化であり、任意の濃度のアレルゲンにおける活性化好塩基球の最大割合に相当する。 EC50は最大活性化の50％における有効量であり、CDsensと表現することも可能である。 CDsensは半最大有効濃度の逆数、すなわち好塩基球の活性化が最大活性化の半分となる濃度を100倍したもので、Johanssonにより最初に報告された。 CDsens = 1/EC50 × 100。 CDmaxとCDsensはそれぞれ、好塩基球の反応性と好塩基球の感受性の尺度である。 好塩基球反応性は、好塩基球活性化の程度、すなわち活性化された好塩基球の割合として定義することができ、異なるアレルゲン濃度におけるCD63陽性好塩基球の割合として、又はアレルゲン及び抗IgEで刺激後のCD63陽性割合の比として測定することも可能である。 好塩基球感度とは、好塩基球が活性化するアレルゲン濃度を指し、先に述べたEC50やCDsensとは別に、最大有効量（例えばEC5、EC10）に対するパーセンテージとして表すことができる。 図3は、好塩基球の反応性と感受性が高い（青）人と低い（赤）人、すなわち高濃度のアレルゲンに反応して活性化する好塩基球の割合が少ない人の、2つの異なる個体の好塩基球反応を表している。 ShrefflerとPatilは、好塩基球反応を測定する新しいパラメーターとして、好塩基球反応性と好塩基球感受性を組み合わせる利点がある用量反応曲線下面積を提案した。 BATはピーナッツアレルギーの診断に高い精度（97 %）を示し、必要なOFCの数を66 %減少させることが可能であった。 我々は、プロスペクティブに独自に募集した集団で診断カットオフを検証し、この2番目の研究集団でもBATの診断性能は非常に良好であった。 過去数年間、ピーナッツ、牛乳、卵、小麦、ヘーゼルナッツ、貝類、桃などの異なる食物アレルギーの診断や、花粉食物症候群の診断において、他の研究がBATの性能を評価している（表1）。 症例報告や小規模ケースシリーズでは、BATはゴマや、米やプレバイオティクスに含まれる短鎖ガラクトオリゴ糖など、IgE介在型食物アレルギー反応の一般的ではない誘発物質に対するアレルギー診断にも有用であることが示唆されている。
BAT の診断性能とカットオフ値には、研究集団、研究デザイン、検査手順、データ解析に採用した方法など様々な要因が影響します（表2）。 既存の研究は、これらの点でほとんど異質であり、そのため、比較可能性や特定の研究で決定された診断カットオフ値をより広く適用することに限界がある。 各食品アレルギーの診断基準はアレルゲンごとに異なり、診断精度はアレルゲンによって異なる可能性がある。 さらに、ある集団で定義されたカットオフ値は、地理的に異なる地域の別の集団にそのまま適用されるとは限りません。 BATの限界の1つは、検査した患者のごく一部が非応答性好塩基球（すなわち、非IgE介在陽性対照には反応するがIgE介在刺激物には反応しない好塩基球）を持ち、したがって検査結果が解釈不能であるという事実である。 BAT を研究手法から臨床の診断検査に移行する際のさらなる課題は、測定法の標準化およびその再現性、さらに食物アレルギーを疑う患者の診断アプローチに BAT を含めることの費用対効果に関連するものである。 これらの側面はまだ確立されておらず、さらなる研究が必要である。
実験室の処置およびフローサイトメトリデータを分析するために採用する方法は、BATについて得られる結果、ひいてはその診断精度に大きな影響を与える可能性がある。 例えば、抗IgE抗体を用いて好塩基球を同定すると、細胞が活性化され、別の方法で同定した結果が変化することがある。 CCR3やCD123といった特定の好塩基球の同定マーカーの発現は、好塩基球の活性化に伴って変化することがある。 最近の研究では、患者の約4分の1において、フローサイトメトリーで検出されるCD123の発現が好塩基球の活性化後に減少し、その結果、このマーカーに依存して好塩基球を同定する方法を用いた活性化細胞の著しい損失対分析につながる可能性があることを説明した。 このことは、誤診、特に偽陰性の増加を招き、個々の患者にとって重要な結果をもたらす可能性がある。 好塩基球特異的マーカーCD203cをゲーティングに加えることにより、細胞数を維持し、偽陰性を減らすことができた（5％から1％へ）。 変更されたゲーティング戦略により、BATの感度（88％から98％）および特異度（94％から96％）はともに向上し、その結果、BATのピーナッツアレルギー診断の精度は91％から97％に向上した（図4）。 BATの実施と解釈を成功させるためには、「悪魔は細部に宿る」。したがって、BATの方法論的側面を注意深く検討することが非常に重要である
好塩基球ゲーティング戦略SSClow/CD203c+/CD123+/HLA-DR-（赤）使用とSSClow/CD123+/HLA-DR-（青）使用の比較でのピーナッツに対する好塩基球活性化検査の診断精度の強化。 ピーナッツ抽出物10および100 ng/mlにおけるCD63+好塩基球の平均値のROC曲線
全体として，BATは診断検査として高い特異性と陽性適中率を示した． 我々は、独立したプロスペクティブに募集した集団でピーナッツアレルギーのために決定した診断カットオフを検証し、BATの特異度と陽性適中率は100 %に達した。 高い特異性は、感度は高いが特異性の低いSPTやsIgEなどの既存のアレルギー検査に追加される重要なものである。 高い特異度は、BATが陽性であれば食物アレルギーの診断を確信できるが、陰性であれば必ずしも診断を否定するものではないことを意味する。 費用対効果や安全性の観点から、BATで結論が出ない患者（すなわち非応答性好塩基球の患者）、あるいはBATで結論が出ない患者およびBATが陰性の患者に対してOFCを実施することが可能である。
BATに続くOFCの必要性を決定するアプローチは、BATの結果を他のアレルギー検査の結果との関連でどのように考えるかにもよる。 先に引用したピーナッツの研究において、我々はBATと他のアレルギー検査を並行して実施し、その成績を比較した。 BAT は SPT、ピーナッツに対する特異的 IgE、Ara h 2 およびその他のピーナッツ成分に対する特異的 IgE よりも良好な成績を示した。 単一の検査を考慮した場合、最も正確な診断検査は BAT であった。 利用可能な情報を最大限に活用するために、BATの結果は他の検査の結果と組み合わせて使用することができる。 しかし、一般に、異なる検査で矛盾した結果が得られるため、使用する検査が多いほど、診断の不確実性が高くなる（OFCの数が多くなる） ……。 アレルギー検査の結果を同時に組み合わせるよりも、他のアレルギー検査で結論が出なかった患者に対して、食物アレルギーの診断ワークアップでBATを順次使用する方が良い場合がある。 この方法は、BATの実施に伴う実際的な問題、すなわち新鮮な血液の必要性、必要な資源および技術的専門知識を考慮すると、実現可能性の観点からも有利となり得る。 食物アレルギーが疑われる患者のすべてにBATを実施することは現実的ではないし、必要でさえない。 BATは、特に食物への経口曝露歴がない場合、あるいは臨床歴が不明確でSPTおよび特異的IgEの結果が不確定である場合など、選択された症例にのみ実施することができる。 BAT は、診断が困難な症例において、病歴、SPT および/または sIgE に続く診断ワークアップの第二段階として、OFC が必要かどうかを決定する前に使用することができる -Fig.5. BATの診断精度と皮膚プリックテストや特異的IgEに対する優位性は、他のアレルゲンや他の臨床場面で評価される必要がある
好塩基球活性化試験は、臨床歴と皮膚プリックテスト（SPT）および/または特異的IgEの組み合わせが決定的でない特定の患者において、食物摂取を試みる前に有用となり得る。 BATが陽性であれば、食物アレルギーの診断が確定し、OFCの実施を延期することができる。 BATが陽性または陰性であれば、診断を明確にするためにOFCを実施する必要がある
食物アレルギー患者と食物耐性患者を区別する以外に、BATの結果は食物誘発反応の特徴に関する追加情報を提供でき、アレルギー患者の管理に有用と考えられる。 BATの異なるパラメータは、アレルギー反応の異なる特徴を反映することが示されており、活性化好塩基球の割合（好塩基球反応性）はアレルギー症状の重症度を、好塩基球がin vitroでアレルゲンに反応する用量（好塩基球感受性）は患者がOFC中に反応した食物蛋白の用量を反映している。 ピーナッツアレルギーにおけるこれらの知見は、その後発表された研究でも再現されており、他の食物アレルギーにも応用できる可能性がある。 いずれにせよ、食物アレルギー患者を評価する際には、BATの結果を他の臨床的特徴や重症化の危険因子との関連で考慮する必要があります。
食物に対する耐性の獲得と食物アレルギーに対する免疫調節治療に対する臨床反応をモニターするために好塩基球活性化試験を用いる
アレルギー患者と耐性患者の臨床表現型を密接に反映させることができる。 BATは、牛乳、卵、小麦アレルギーなど、一般的に時間の経過とともに治癒する食物アレルギーの自然治癒を評価し、その食物を食事に再び取り入れることができるかどうかを評価するために、患者に再チャレンジするタイミングを決定する際に有用であると考えられます。 BATは、牛乳や卵アレルギーの患者の異なる表現型、すなわち、これらの食品を広範囲に加熱しても耐性があり、非加熱食品にも反応する患者と、広範囲に加熱した牛乳や卵と非加熱の両方に反応する患者を区別することが示されています
BATは、研究において食物アレルギーに対する免疫調節治療に対する臨床反応をモニタリングするために使用されてきました。 全体として、ピーナッツ、牛乳、卵などの食品に対する免疫療法の研究において、BATは治療によりそれぞれの食物アレルゲンに対する好塩基球反応性の低下を示し、これは特に低濃度のアレルゲンで顕著であり、好塩基球感度の低下を反映しています。 興味深いことに、Thyagarajanらは、ピーナッツOIT中、好塩基球活性化の減少は、ピーナッツだけでなく、バイスタンダーである卵アレルゲン（卵アレルギー患者）および抗IgEには反応するが、非IgE媒介陽性対照であるfMLP（ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン）に対しては起こらないことを示しており、IgE受容体の下流の経路がアネルギー状態になったことが示唆されている。 ピーナッツアレルギー患者を対象としたオマリズマブの研究では、BATのCD203c発現が治療中に減少し、治療中止後に治療前のレベルに戻った。 最後に、漢方薬のFAHF-2も、臨床的な改善と並行して、さまざまな食品に対するアレルギー患者の好塩基球反応を有意に抑制する効果を示した。
これらの研究を総合すると、経口免疫療法、舌下免疫療法、omalizumab、その他の免疫調節治療または予防戦略など、何らかの介入によって食物アレルギー物質に対する免疫反応の変化を評価するために、同じ患者において長期にわたってBATが反復できることがわかっている。
今後の展望
食物アレルギーの診断にBATを臨床応用するためには、特定のアレルゲンや異なる患者集団における診断カットオフを定義し検証するためのさらなる研究が必要である。 BATの結果を施設間で比較できるようにするためには、検査手順の標準化が重要であろう。 そのためには、in vitroアッセイのプロトコル、フローサイトメトリーおよびデータ解析の方法の標準化が必要である。 BATに同様の方法を用いることで、臨床および研究目的（多施設共同研究を含む）の両方で、異なる施設におけるBATの結果を比較できるようになる。
いったん特定の食物アレルギー診断のために適切に検証されれば、BATはアレルゲン特異的免疫療法や生物学的薬剤などの免疫調節治療に対する臨床反応をモニタリングするために用いることができる。 また、BATは、食物アレルギーや食物耐性の免疫機構における好塩基球の役割に関する理解を深めるためのメカニズム研究にも大きな可能性を持っている
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