タンパク質アッセイは生命科学研究においてさまざまな用途がありますが、すべての用途に適した単一のアッセイ方法は存在しません。 現代科学のあらゆる進歩にもかかわらず、タンパク質以外の成分やタンパク質組成の違いに影響されないタンパク質アッセイ法は存在しないのです。 そのため、タンパク質研究室では、研究用途に応じて複数の種類のタンパク質アッセイを用意する必要があります。 したがって、実験から正確な結果を得たいのであれば、アプリケーションに最も適したアッセイを選択することができるはずです。
Types of Colorimetric Protein Assays
関与する化学に基づいて、トータルタンパク質の比色検出および定量のための2つの最も一般的な方法は、タンパク質-色素結合アッセイおよび/または銅イオンベースのキレートアッセイです。
色素結合アッセイ
ブラッドフォード（クーマシー）および660nmタンパク質アッセイなどの色素結合アッセイは、酸性条件下でのクーマシー色素へのタンパク質分子の結合に基づくものである。 タンパク質分子が色素に結合すると、色は茶色（Amax=465nm）から青色（Amax=610nm）へと変化する。
塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）は色素-タンパク質複合体の形成とそれに伴うスペクトルシフトに重要な役割を果たすが、より小さなタンパク質（3kDa以下）やアミノ酸は色の変化を生じない。
銅イオンベースのアッセイ
銅イオンベースのタンパク質アッセイでは、タンパク質溶液を銅塩のアルカリ溶液と混合し、ペプチド結合と銅イオン（Cu2+）のキレート化を促進し、その後銅イオン（Cu2+）を銅イオン（Cu+）に還元させる。 銅イオンに基づくタンパク質アッセイは、(1)還元された銅イオン(Cu+)を検出するアッセイと(2)結合していない銅イオン(Cu2+)を検出するアッセイに分けることができる。 銅イオンの検出には、ビシンコニン酸（BCA）やフォリン試薬（リンモリブデン酸/リンタングステン酸）を用いることができる。 使用した試薬が還元されると、青色を呈します。 発色量は650nm～750nmで読み取れ、ペプチド結合の量に比例します。
注：タンパク質中にチロシン、トリプトファン、システイン、ヒスチジン、アスパルギニンが存在すると発色濃度が上がります。
未結合銅イオンの検出による測定では、アルカリ銅をタンパク質溶液と混合し、銅イオンと反応する発色試薬で未結合銅イオンを検出する。 発色量は試料中のペプチド結合量に反比例する。
プロテインアッセイの選択。 考慮すべきいくつかの要因
アッセイを選択する際に考慮すべき要因は数多くあります。 ここではそのいくつかを紹介します。
- 試料タイプや成分との適合性。 タンパク質サンプルの性質やタンパク質溶液中の非タンパク質薬剤の有無は、実験結果に大きな影響を与える可能性があります。 還元剤、金属キレート剤、染料、アミン、糖類の存在は銅ベースのタンパク質アッセイに干渉し、洗剤を含むタンパク質溶液は染料ベースのタンパク質アッセイに干渉することに留意してください
- アッセイ範囲と必要サンプル量について。 ほとんどの比色定量法では、信頼性の高い推定値を得るために、少なくとも0.5µgのタンパク質を必要とします。 そのため、入手困難なサンプルについては、信頼性の高い推定のために必要なサンプル量が最も少ない方法を検討する必要があります。 色素を用いたタンパク質アッセイや、亜銅イオンから銅イオンへの還元を伴うものは、タンパク質間で大きなばらつきがある。 サンプルの複雑さと選択したアッセイ方法によって、タンパク質アッセイを行うために必要な時間が決定されます。 干渉物質を含むタンパク質サンプルや標準プロットまたは標準曲線を使用するアッセイでは、より多くの時間を消費します。 アッセイによって生じた色（吸光度）を測定するために必要な分光光度計やプレートリーダーの有無も選択に影響を与える可能性があります。