ORIGINAL PAPERS
Description of a widespread outbreak of aseptic meningitis due to echovirus 30 in Rio de Janeiro state, Brazil
Vitor Laerte Pinto JuniorI; Maria Cristina RebeloII; Eliane Veiga da CostaIII; Edson Elias da SilvaIII; Márcio Neves BóiaIV
IDiretoria Regional de Brasília, Fiocruz, Brasília, DF
IILaboratório de Referência Estadual para Meningites, Instituto Estadual de Infectologia São Sebastião,
IIILaboratório de Enterovirus, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ
IVPós-graduação em Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ。 ブラジル
通信先
概要
エコーウイルス30はエンテロウイルス属に属し、無菌性髄膜炎（AM）のアウトブレイクと広く関連している。 ブラジルではこの血清型による流行がいくつかの州で報告されているが，リオデジャネイロでは本研究以前は散発的なエピソードにのみ関与していた。 本研究では，リオデジャネイロ州保健局（RJSHD）およびエンテロウイルスレファレンスラボラトリーから，2005年のAM感染者届出表およびエンテロウイルス分離データベースのデータをレトロスペクティブに収集した． 3月，4月，5月にAMの集団発生が認められ，エコーウイルス30株の細胞培養分離率が高かった（17.4％）． 年齢が1歳から9歳の男児が多く罹患していた。 エコーウイルス30の感染が確認された22名の患者のうち，臨床情報が得られたのは8名であり，発熱，頭痛，嘔吐が主な症状であった． 髄液分析では，細胞数の中央値が100個/mm3，単核球優位の症例が64.7%と，典型的なウイルス感染のパターンが認められた． タンパク質とグルコースレベルの中央値は49 mg/dLと56.5 mg/dLであった。 致死率はゼロであった。 無菌性髄膜炎のサーベイランスは，その良性の経過と治療法の欠如にもかかわらず，集団発生時の原因物質の早期同定に極めて重要であり，追加検査や抗菌薬の不適切な使用を回避するのに役立つと思われる．
Key-words: 無菌性髄膜炎、エンテロウイルス、エコーウイルス、脳脊髄液。
エコーウイルス30はエンテロウイルス属に属し、主に流行性のAMの症例に関連している。 この血清型は発生率が増加しており、ここ数年、最も頻繁に検出されるエンテロウイルスの一つとなっている。 ブラジルでは、いくつかの州（リオグランデ・ド・スル州、パラナ州、サンパウロ州、ペルナンブコ州、パラ州）でAMの集団発生の原因ウイルスとして既に報告されており、高齢の子供や成人に多く見られ、症例死亡率は低くなっています。
材料と方法
被験者
本研究では、リオデジャネイロ州保健局（RJSHD）の髄膜炎諮問委員会のデータベースから2005年のAMの届出例573件の疫学および人口統計データをレビューし、分析した。 急性髄膜炎の症状（発熱，頭痛，嘔吐，項部硬直，神経過敏または嗜眠）を有し，髄液プロファイルで白血球数が6866> 10 cells/mm3，細菌学的検査が陰性の年齢不詳の患者をAMとした．
臨床検体のCSF分析
すべての患者は髄膜炎評価のために腰椎穿刺を受けた; 研究のためのサンプル収集のみを目的としてこの処置を受けた患者はいなかった。 髄液は、細胞含有量、タンパク質およびグルコースレベル、および細菌学的検査について、実験室のルーチンメソッドで分析された。
ウイルスの分離と同定
すべての検体（AMを調査する患者からのCSFおよび糞便抽出物）は、ウイルス分離の目的で0.2mLの容量で細胞培養物に接種された。 RD（ヒト横紋筋肉腫）およびHEp2（ヒト喉頭癌）は、ほとんどのエンテロウイルス血清型の複製をサポートする能力があるため、連続した細胞系を選択した。 このチューブを36℃で7日間保持した後、ブラインドパッセージを行い、さらに7日間36℃に保持した。 細胞障害性効果（CPE）を示す細胞培養物は、さらに同定されるまで-20℃で保存された。
エンテロウイルスに特徴的なCPEを示す検体は、メーカーのプロトコールに従って、Trizol LS ®（Life Technologies）を使用してRNA抽出に供された。 Obersteらにより記載されたメインカプシドタンパク質VP1をコードする遺伝子内部の357bp断片を増幅するプライマー対（R – 222およびF – 292）を用いて特異的エンテロウイルスグループRT-ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）が実施された。 GeneAmp® PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems) を用いて、95℃での変性、42℃でのアニーリング、60℃での伸長を30サイクル行った後、50 bp ladder (Invitrogen) を分子量マーカーとして、エチジウムブロミド (0.5 mg/mL) 入り1%アガロースゲルで電気泳動し、トランスイルミネーター (UV light) で視覚化することにより生成物を分析した。 QIAquick® Gel Extraction” (Qiagen) キットを用いて精製し、1%アガロースゲルで Low DNA Mass Ladder (Invitrogen) の分子量マーカーと比較することにより、特異的産物を定量した。
サイクルシーケンス反応は、ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied-Biosystems) を用いて、GeneAmp®サーモサイクラーで、95℃1分、42℃3分、60℃3分のサイクルで実施した。 222と292の両プライマーを用いて得られた配列産物をイソプロピルアルコール沈殿で精製し、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) を用いて解析した。 エンテロウイルスの血清型は、GenBankにある配列と比較し、Program Blast .NETを使用して求めた。
流行図の作成と統計解析
患者のカルテとRJSHDからのすべてのデータは、SPSS statistics software, version 13.0 for windows (SPSS, Inc., Chicago, IL.) を用いて挿入・解析された。 記述的統計ツール（平均値、中央値、標準偏差）を実行した。 無菌性髄膜炎の年間発生率は、ブラジル地理統計院（IBGE）の2007年推計の人口データを分母として評価された。
倫理
この研究は、人間を含む研究に関するブラジルの法律に従って予測され、リオデジャネイロのFIOCRUZ、エヴァンドロ・シャガス臨床研究所の倫理委員会によって承認されています。
結果
人口統計学的および疫学的データ
2005年にリオデジャネイロ州で合計573例の無菌性髄膜炎が通知され、発生率は人口10万人当たり3.71例であった。 年齢と性別の分布は表1の通りであった。 症例の多くは1歳から9歳の小児で、この年齢層では男性が60.7％、女性が39.3％を占めている。 この年齢層では、男性が60.7％、女性が39.3％を占め、それ以上の年齢層では性別の優位性は観察されなかった。
AMの症例は、リオデジャネイロ大都市圏に集中して調査期間中に発生しました。 AM患者の頻度分布は、3月から5月の間に流行期があることを示していた（図1）。 流行初期は3月に99例（予想36例）で始まり、4月に122例（予想38例）で最盛期を迎え、5月に58例（予想39例）で終息した。 ブラジルでは、この時期は夏の終わりと秋の始まりに相当します。
エンテロウイルスの分離と同定
2005年の1年間にAM患者から171例のCSFおよび糞便検体がエンテロウイルスについて分析され、ウイルス分離に送られた検体の数はこの期間に1ヵ月あたりゼロから85例まで変動したが、48例のうち（28.0％）のうち，エコーウイルス30がCSF17例，糞便5例から検出された（陽性検体の45.8％）． このウイルスは流行期にのみ検出され，平均分離率は17.4％（22/126）であった． その他の26検体（54.2％）の髄液からは，流行期以外に非配列型の非ポリオエンテロウイルスが検出された（図2）。
臨床的側面 エコーウイルス30病を確認した22例中，臨床データは8例，CSF分析結果は17例すべてで確認されている。 男性優位（54.5％），年齢は2歳から36歳（中央値4.5歳）と幅があった。 主な症状は、頭痛100.0%（8/8）、発熱87.5%（7/8）、嘔吐62.5%（5/8）、項部硬直52.5%（5/8）であった。 髄液検査では，白血球数100個/mm3（中央値），単核球数64.7%（11/17），白血球数32〜325個/mm3の多核球症が認められた． 蛋白は中央値49 mg/dL（28～84 mg/dL），ブドウ糖は中央値56.5 mg/dL（43～92 mg/dL）とやや高値であった． 症例致死率はNULLであった。
考察2005年にリオデジャネイロ州で発生したエコーウイルス30関連の最初のアウトブレイクを、臨床、実験室、疫学的側面から報告したものである。 この集団発生は3月に始まり、4月末まで進行し、6月に流行レベルに戻った。
無菌性髄膜炎は幅広い病因が考えられる症候群であり、ブラジルではほとんど報告されていない。 しかし、過去30年間に世界のさまざまな地域で行われたAMの病因を調査したいくつかの研究によると、ポリオ以外のエンテロウイルスが52％から92％の頻度でほとんどの症例に関与していることが判明している。
本研究では、AM症例の性別と年齢分布は、エンテロウイルスによる中枢神経疾患に関する他の研究で報告されているパターンと類似しており、男性優位で1歳から9歳の小児が罹患していることが示された。 男性優位の理由は不明であるが、この性別は、感染に関与する危険因子にさらされる度合いが高いためと推測される。
温帯地域のAM症例は、季節的な分布があり、おそらく学校の休暇やレクリエーション活動の時期と関連して、夏に発症のピークを迎えると報告されている 。 熱帯・亜熱帯地域では、本研究で作成した流行図に示すように、AMの症例は年間を通じて一様に分布している。 dos Santosらも同様のパターンを示したが、気温の高い時期に患者が発生する傾向があった。
エコーウイルス30は流行パターンがあり、AMは最もよく報告される症候群である。 この血清型は、過去にブラジルのいくつかの州（Paraná、Rio Grande do Sul、Pernambuco、Pará）でAMのアウトブレイクを引き起こしたが、臨床経過および結果は常に良性であった。 世界の他の地域では、エコーウイルス30はすでにAM患者の髄液から最も頻繁に分離される血清型であり、米国の監視データは、エコーウイルス30が、静止期間を挟んで大規模なアウトブレイクを引き起こしたことを示唆している。 また、エコーウイルス30は、大流行時に5つの異なる遺伝子型を持つことが分子疫学的に証明されており、このような疫学的挙動を説明することができるものと考えられている。
リオデジャネイロ州では、2001年からAMの散発的なケースに関連したエコーウイルス30の循環が報告されている。 2005年の3月から5月にかけて、AMの届出患者数がその時期の流行レベルを超えて増加した。 同時にエンテロウイルス研究所に送られた臨床検体からエコーウイルス30が分離され，その割合は17.4％と散発例で通常とされる10％未満をはるかに超えていた。 この高い分離率は、2001年に台湾で発生したエコーウイルス30に関連する集団発生で報告されたものと同様であった。 これらのことから、本州で初めてエコーウイルス30型による集団感染が発生したことが確認された。
臨床的には、発熱と頭痛が最も一般的な症状として突然発症する典型的な髄膜炎症候群が観察された。 症例致死率はゼロであり，エコーウイルス30型が良性であることが確認された． しかし，長期にわたる神経学的後遺症を除外するためには，これらの症例に対する前向きな神経学的評価が必要であろう．
本研究で提示したサーベイランスデータは、エンテロウイルス以外の原因物質、例えばLeptospira属、デングウイルス、Bartonella属、Herpes simplex virusが我が国では珍しくないため、おそらくエンテロウイルスが原因でないものも含めて全届出症例を示している。 リオデジャネイロのAMの病因に関する疫学的データはほとんど知られていないため、私たちの環境におけるAMの症例にエンテロウイルスが関与する実際の範囲は未解決の問題である。 エンテロウイルスは、ほとんどの場合、糞口汚染によって獲得されるが、これは食物や水のような共通の感染源との接触、あるいは人から人への接触に関連している可能性がある。 しかし、レトロスペクティブデザインによる方法論の制約から、このような解析はできなかった。
エコーウイルス30は、良性の結果をもたらす無菌性髄膜炎の発生と関連している。ブラジルではこの血清型の頻度が増加し、静止期間中にAMの大発生が現れると予想される。 AMサーベイランスを強化・改善することは，集団発生の原因菌を早期に特定し，追加検査や不必要な抗菌薬使用を避けるために極めて重要である． ブラジルにおけるAMの他の原因菌の確定とその伝播メカニズムの解明には、さらなる研究が必要である。
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