グリセロールから1,3-プロパンジオルまたは3-HPを生産するにあたり、乳酸が主副産物となって製品収率を大きく低下させることがわかった。 そのため、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠失させることで、乳酸の生成を抑える試みがなされている(Kumarら2013b;Zhongら2014)。 1,3-プロパンジオールと3-HPを生成する反応は、いずれも共通の基質である3-ヒドロキシアルデヒド(3-HPA)を奪い合うため、プロパンジオール酸化還元酵素の欠失は3-HPの生成を優先する(Ashok et al.2011)。 そこで本研究では、ldhAとdhaTの遺伝子をノックアウトして3-HPの生産を促進した。
ldhA欠損の3-HP生産への影響
図S2Aに示すようにldhA欠損株JJQ01を構築してldhAのノックアウトが確認された。 組換え株 Kp4(pUC18-kan-aldH) と JJQ01(pUC18-kan-aldH) を構築し、5L バイオリアクターでフェッドバッチ発酵を実施した。 Kp4(pUC18-kan-aldH) は 38 時間で 18.3 g/L の 3-HP を 0.21 mol/mol の収率で生産し、乳酸は 32.2 g/L で 0.34 mol/mol の高い収率で生産された。 さらに、17.6 g/L 2,3-butanediol, 6.1 g/L 1,3-propanediol, 10.7 g/Lの酢酸が生成された。 乳酸の生成は、コストだけでなく、乳酸の異性体である3-HPの回収の難易度を高める。 さらに、乳酸は3-HPと1,3-プロパンジオールの生合成の主な阻害剤である(Xu et al.2009b; Kumar et al.2013b). ldhAを欠損させると、乳酸の生成が効果的になくなり、図2bに示すように、3-HPの生産量は48.3 g/L、収量は0.28 mol/molを達成した。 この ldhA 欠損株における 3-HP の濃度と収率は、Kp4(pUC18-kan-aldH) 株に比べてそれぞれ 1.64 倍と 33.3% 増 加していることがわかった。 また、エタノールの生成量が4g/L程度と少ないことを除けば、野生株を用いた場合にほとんど見られなかったピルビン酸やギ酸の蓄積もldhA変異株では検出されなかった
これらの結果から、乳酸生成阻害が炭素フラックスを3-HP生成に大きく振り向けることが明らかとなった。 DhaBを介したグリセロール同化は著しく改善され、ほぼ0.4 mol/molのグリセロールがDhaBを介して3-HPAに向けられ、これは他の研究(Kumarら2013b;Xuら2009b)と一致した。 乳酸の低減は、細胞への毒性を低下させ、細胞増殖と3-HPの生産性を向上させることができた。 しかし,乳酸の低減は,2,3-ブタンジオールおよび1,3-プロパンジオールの生成を促進し,それぞれ 21.9 g/L, 0.13 mol/mol および 18.5 g/L, 0.12 mol/mol の収量に到達した。 ldhA 欠損により、3-HP の蓄積量が増加し、過剰な NADH が生じた場合、乳酸の代わりに 2,3-butanediol および 1,3-propanediol の生成を促進し、NAD+ を再生してレドックスバランスを保つことができると考えられる。 実際、エタノールの生成もNAD+の再生を促し、ピルビン酸からエタノールへのフラックスがピルビン酸へのフラックスよりも高くなった。
dhaT欠損による3-HP生成への影響
ldhAの欠損は3-HP生成を劇的に促進し、同時に1,3-プロパンジオールの生産も18.5g/Lまで促進した。 Koら(2017)は、酢酸などの副生成物を還元することで43g/Lの3-HPと21g/Lの1,3-プロパンジオールが得られたと報告している。 1,3-プロパンジオールの生成は補酵素の再生によりグリセロール利用に有利であるが、グリセロール炭素フラックスのかなりの部分を占めている。 1,3-プロパンジオールと 3-HP は同じ前駆体 3-HPA に対して競合するため、1,3-プロパンジオールへのフラックスを制限するために、ldhA と dhaT のダブルノックアウト株 (Additional file 1: Figure S2B) JJQ02(pUC18-kan-aldH) を構築した。 5-L リアクターでのフェッドバッチ発酵の結果を図 2c に示す。 予想外に、ldhA と dhaT の同時ノックアウトは、収量が 0.32 mol/mol グリセロールに増加したにもかかわらず、3-HP が 44.5 g/L にしかならない。 dhaTの欠失は、1,3-プロパンジオールの力価および収率をそれぞれ9.9 g/Lおよび0.07 mol/molに低下させた。 しかし、YqhD や他の酸化還元酵素が触媒する反応では、依然として 1,3-propanediol が生成された (Ashok et al. 2013)。 さらに、JJQ01(pUC18-kan-aldH)と比較して、2,3-ブタンジオール生産量は21.9 g/L から 23.4 g/L へわずかに増加し、ALDH 触媒反応から得られる過剰 NADH を消費するために 2,3-butanediol pathway へのフラックスが増加したことを示している。 1,3-プロパンジオール合成は,K. pneumoniaeの酸化還元バランスを調節する上で重要な役割を担っている。 この酸化経路では、グリセロールから酢酸1分子が生成されると3分子のNADHが生成され、同時に1分子のATPが生成される。 その結果、ldhAとdhaTの両方を欠損させると、NAD+の再生能力が大きく低下し、2,3-ブタンジオールの生成により多くのNADHが酸化され、2,3-ブタンジオールが増加することがわかった。 曝気速度を下げる(酸素供給を制限する)と、より多くのATPを供給するために酢酸の生産が促進されるが、同時に多くのNADHが生成され、2,3-ブタンジオールの生産がさらに増加する結果となった。 しかし、再生されたNAD+は、DhaTによる触媒反応で生成されたものより少ないと思われ、3-HPの生産量が低下した。 したがって、微好気性発酵における3-HP生産には、DhaBの活性やグリセロールの異化に影響を与えず、NAD+を生成するのに適した量の酸素を供給することが重要である
本研究では、dhaT遺伝子を欠損させて3-HPを改善することはできなかった。 グリセロールの異化はグリセロールデヒドロゲナーゼDhaD、グリセロールキナーゼGlpK、グリセロールデヒドラターゼDhaB、1,3-プロパンジオール酸化還元酵素1,3-PDORsによって制御されている。 グリセロール分岐点の硬直性から、グリセロールフラックス分配に関わる遺伝子の欠失による3-HP産生の向上は困難であることが示唆された。 Ashokら(2011)は、dhaT遺伝子欠損後のDhaD、DhaB、ALDH、1,3-PDORの本来の活性を測定している。 彼らは、DhaDの活性はわずかに改善され、ALDHの活性はわずかに低下し、DhaBの活性は著しく低下することを見いだした。 Zhang ら (2008) は、グリセロール分解経路の分岐点における頑健性についても解析している。 8200>
3-HP生産における曝気の影響
我々のこれまでの研究では、微好気性条件が3-HP生産に有利であることが示された。 嫌気性プロセスと比較して、微好気性発酵ではアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現レベルが高いため3-HPの生産が著しく向上し、同時に1,3-プロパンジオールの生産が減少した(Huangら、2013)。 Wang ら(2011)は、K. pneumoniae のグリセロールデヒドラターゼの比活性が、給気量 0.04 vvm で、給気しない場合に比べて 59% 高まったと報告している。 しかし、グリセロールデヒドラターゼは酸素によって急速に失活することが報告されており(Toraya 2000; Ruch and Lin 1975)、3-HP産生に大きく影響した(Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017)。 さらに、DhaBの補酵素であるコエンザイムB12は、K. pneumoniaeなどの天然3-HPA生産者の多くで高曝気条件下では十分に合成されない。 Huangら(2013)およびKoら(2017)も、高好気性条件は3-HP生産に有益でないことを示しました。 そこで、異なる通気条件下で予備的なフェッドバッチ実験を行ったところ、高い通気率を維持することは、細胞増殖停止後の3-HP生産に不利であることも判明した(データ未掲載)。 JJQ02(pUC18-kan-aldH) のフェッドバッチ培養では、OD650 が最大値まで閉じた時点で、初期値の半分の曝気量を採用した。 図3に増殖、グリセロール、代謝物のプロフィールを示すが、黒矢印は通気量を下げる時点(0.5vvm)を示す。 3
5Lバイオリアクターでのフェッドバッチ発酵におけるJJQ02株(pUC18-kan-aldH)による細胞密度、3-HPおよびその他の代謝物のプロファイルを示したもの。 OD650(後方下向き三角形);3-HP(黒丸);PDO:1,3-プロパンジオール(後方下向き三角形);BDO 2,3-ブタンジオール(後方左向き三角形);酢酸(黒ダイヤ);黒矢印は通気速度を下げる時点
3-HP 最終タイターは61に達した。JJQ02(pUC18-kan-aldH)による3-HP濃度と収率はKp4(pUC18-kan-aldH)の3.3倍と2.76倍、JJQ01(pUC18-kan-aldH)の1.28倍と2.07倍であることが確認された。 その結果、1,3-プロパンジオールと2,3-ブタンジオールの生産は20時間で停止したが、3-HPの力価はこの時点から生産速度が低下するものの、増加し続けることが確認された。 微好気性発酵の後半では、1,3-プロパンジオールと 2,3-butanediol の生成により NADH はほとんど再生されないが、NAD+ を再生する最も効率的な方法は、酸素存在下の電子輸送鎖を介した方法であるため、一部の NADH は再生されうる (Richardson 2000; Kumar et al. 8200>
300-L scale-up fermentation
JJQ02(pUC18-kan-aldH) 株の大型バイオリアクターでの 3-HP 生産の実行可能性を調べるために、5-L発酵槽で確立した発酵条件に従って300Lバイオリアクターで供給バッチ発酵が行われた。 3-HP は 54.5 g/L、収率 0.43 mol/mol を達成し、1,3-プロパンジオールの濃度および収率は 12.2 g/L および 0.11 mol/mol, 21.3 g/L および 0.3 mol/mol であった。51時間で2,3-butanediolが21.3 g/L, 0.17 mol/mol、acetateが9.3 g/L, 0.11 mol/molだった(図4)
5L反応器で得られた結果と比較すると、300L反応器は明らかに2,3-ブタンジオールの力価およびモル収率が増加しており、5L反応器で一定の通気速度1 vvmで同じ菌株で得た結果と同様であることがわかった。 これは、2,3-ブタンジオールの生産には適切な曝気速度が必要であることを示す研究があるため、曝気速度を低下させた 5-L リアクターよりも 300-L リアクターの酸素移動がやや高い可能性を示唆している (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014)。 300L リアクターの曝気条件下では、2,3-ブタンジオール生成に関連する酵素の発現と NADH プールまたは NADH/NAD+ 比が 2,3-butanediol 生産を促進し、DhaB および AldH の発現は若干影響を受ける可能性があることが示された。
酸化還元バランスを考慮し、ldhA dhaT二重変異株では、ALDHが触媒する反応で生成したNADHは、一部が2,3-ブタンジオールとエタノールやコハク酸などの還元代謝物の生成、一部が電子輸送鎖で再生された(リチャードソン 2000; クマールら 2013b)。 したがって、マイクロ曝気発酵における曝気速度は、最終生成物に大きく影響した。 300Lリアクターでの発酵では、曝気速度が初期の半分になったとはいえ、バイオプロセスのスケールアップで従来から話題になっていた酸素移動特性が異なるため、5Lリアクターでの発酵とは酸素移動状況が大きく異なる可能性があります。 反応器ごとの生成物分布の違いから、酸素供給の精密な制御が重要であることがわかり、一方、曝気量を減らすだけでは大雑把すぎるように思えた。 しかし、3-HPの力価や収量は5L反応器とは若干異なるものの、スケールアップには成功した。 300L反応器と5L反応器では酸素移動の性能が異なるため、300L反応器の曝気速度をさらに正確に制御することで、3-HPレベルを向上させることができると期待された。