Frontiers in Microbiology

はじめに

バクテリオファージは、ほとんどすべての微生物コミュニティーで重要な役割を果たしているため、科学研究の焦点になっています。 バクテリアのウイルス捕食者として、彼らはさまざまな環境における微生物集団とダイナミクスに大きな影響を及ぼしている。 海や人体などの異なる生息環境におけるバクテリオファージの役割について扱ったいくつかのレビューがあります（Clokie and Mann, 2006; Wahida et al, 2016; Łusiak-Szelachowska et al, 2017）。 100年以上前、別々にFrederick Twortによって、その後Felix D’Herelleによって発見されて以来（Salmond and Fineran, 2015）、東欧諸国では細菌感染症の医療にバクテリオファージが用いられてきたが、その他の地域では抗生物質が主役だった（Myelnikov, 2018）。 現在では、多剤耐性菌による感染症が世界的な脅威となっているため（Zaman et al, 2017）、バクテリオファージ療法でおそらく最も長い経験を持つグルジアのトビリシにあるエリアバ・バクテリオファージ・微生物学・ウイルス学研究所（Kutateladze and Adamia, 2008）や、ポーランドのヴロツワフのルドウィック・ヒルズフェルド免疫学・実験治療研究所のバクテリオファージ療法ユニットでも世界中から患者が治療を受けています（Międzybrodzki et al.） バクテリオファージの応用は、医療分野だけでなく、細菌が悪影響を及ぼす可能性のある他の分野でも貴重な解決策になる可能性があります。 (米国ユタ州サンディ)、Intralytix Inc. (米国メリーランド州ボルチモア)は、食品産業における殺菌剤として、サルモネラ菌、大腸菌、リステリア菌に対して使用できるさまざまなバクテリオファージ製品を開発しています。 ヨーロッパでは、オランダの企業Micreos BV（オランダ、ワーヘニンゲン）もサルモネラ菌と大腸菌をターゲットに、ドイツの企業Fink Tec（ドイツ、ハム）も大腸菌をターゲットにバクテリオファージ製品を販売しています（Moye et al.、2018）。 バクテリオファージのより広い応用は、多様な植物や魚の幅広い病原体が大きな経済的損失を引き起こす農業や養殖を含む食品バリューチェーンで期待されている（Buttimerら、2017；Dossら、2017）

バクテリオファージ製品のいくつかはすでに商業化されているものの、バクテリオファージ生産の効果的で一定かつ制御できるプロセスはまだ達成されていない。 研究室でのファージ生産は日常的なプロセスと考えることができ、プロトコルは十分に定義されているが、これらのプロセスは容易にスケールアップすることができない。 産業界は、プロセスのスケールアップを可能にする信頼性の高いファージ生産方法を得ることに大きな関心を寄せています。 しかし、システムの生物学的性質や、ファージと細菌の間で起こる多様な種類の相互作用のために、解決は容易ではない。

バクテリオファージ生産のための信頼できる方法を生み出す試みがいくつかなされてきた。 シミュレーションモデルによる理論的なアプローチもあれば、実験による実践的なアプローチをとる研究者もいた。

バクテリオファージ生産の一般性

バクテリオファージの生物学的性質は、宿主細胞内での繁殖を余儀なくされることである。 したがって、バクテリオファージの生産方法には、宿主菌の増殖とバクテリオファージの増殖（または感染）という少なくとも2つの動作単位を含む生産工程が必要となる。 菌の増殖とファージの感染には、菌の基質や最適温度などの基本的なパラメータがファージの感染性に影響を与える可能性があるため、菌の増殖とファージの感染の両方を考慮することが重要です（Tokman et al.、2016）。 同様に、吸着速度、バーストサイズ、潜伏期間などの様々な感染パラメータを含む、生産するファージの生物学を知ることが重要であるが、後述するように、これらのパラメータは感染条件によって変化しうる（Santos et al.） さらに重要なことは、細菌宿主と選択したファージの間で起こりうる特定の相互作用（例えば、細菌にCRISPR-casシステムがあるかどうかなど）を深く理解することが推奨される。これらの要因は、ファージの感染プロセスに強い影響を与える可能性があるからだ（Levin et al. また、宿主として非病原性細菌株を選択することが推奨される。 産業レベルでのバクテリオファージ生産には大量の宿主細菌が必要となるため、ファージ生産プロセスでは、強毒性薬剤耐性、特に多耐性病原体の使用を避けることが必須である（Torres-Barceló, 2018）。 同じことが、プロファージを有する細菌にも当てはまり、それらはプロセス中に誘導され、最終結果を変える可能性があるからである（Stewart and Levin, 1984）。

実験室で得られたデータが生物学的プロセスのスケールアップに必ずしも有用ではないため、大規模バクテリオファージ生産の信頼できるプロセスは非常に見つけにくい場合がある(Kwok, 2010)。 研究者たちは主にコンピュータシミュレーションに基づくバクテリオファージ生産に関する研究を通じてこのギャップを埋めようとしてきたが、そのうちのいくつかは実験的に検証されたものである。 ここでは、まずファージ生産モデルに焦点を当てた理論的研究を分析し、次に実験的に検証された研究を選びます。 すべてのケースは、バクテリオファージベースの製品のさらなる精製と検証のためのアッセイ基準に一致し、それらのいくつかは両方のセクションに含まれています（Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018a）

バクテリオファージ生産の理論モデル

数学モデルによってファージ生産のプロセスを記述するには、モデル内に含むべき運動パラメータを定義することが重要である。 ファージ生産に関する3つの基本パラメータは、感受性非感染菌、ファージ感染菌、および遊離ファージの集団である（Krysiak-Baltyn et al.、2016）。 これを皮切りに、さまざまなモデルが耐性非感染菌（Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018）や複数の細菌種（Levin et al., 1977）などの追加変数を含んでいます。 これらの集団はすべて、細菌の増殖およびファージ感染に関連する動力学的パラメータによって相互制御される。 どの定数が細菌にとって重要であるかはよく知られていると考えられるが、バクテリオファージについてはまだ議論中である。 吸着定数、潜伏期間、バーストサイズが考慮すべき重要な変数であることは一致しているが、モデルにおけるそれらの関連性は研究によって異なっている。 さらに、著者によって速度論的パラメータの定義に異なる命名法が用いられており、異なるモデル間の比較を確立し、このトピックに関する一般的な知識を統一することが困難な要因の1つになっています。 例えば、ファージの吸着速度（細菌に吸着したファージ粒子の指標）は、一般に「δ」という記号で呼ばれるが、Beretta and Kuang（1998）は「K」という記号を用いており、これはMonodの基質特異性定数「Ks」の記号でもある。 その他の命名法の違いの例を表1に示す。 他の生物学的プロセスと同様に、ファージ・バクテリア増殖モデルの分野で働く著者は、最近Krysiak-Baltynら（2018）が述べたように、特定の代数的語彙に同意するか、論文に用語と単位の明確な説明を含め、明確な命名法を用いることが期待されている。 他の著者によって使用された命名法（表1）に基づき、我々はファージ生殖における異なる動力学的パラメータに名前を付けるためにギリシャ文字の使用を提案する。 バーストサイズはβ、吸着速度はε、ファージ崩壊速度はλで記号化できます。 唯一の例外は、一般的に “P” として知られているファージ濃度と “L” として知られている潜伏時間でしょう。 この数学的言語の統一は、将来の学術的または産業界の査読者の理解とデータマイニングを容易にする。

Campbell（1961）に始まり、バクテリオファージ生産のモデルを記述するために多くの努力がなされ、いくつかの条件と方法におけるファージ集団の挙動を記述している。 表1は、微分方程式または積分方程式（各著者の決定による）として与えられた、さまざまなファージ生産モデルをまとめたもので、各モデルに対する特定の考察に言及している。 これは、単位時間あたりのファージ粒子またはプラーク形成単位(PFU)、バッチプロセス後に得られる最終濃度、または連続プロセスにおける一定期間中の動力学的変化として表されることがある。 しかし、これらのモデルには、いくつかの点で相違がある。 Campbell (1961) とBeretta and Kuang (1998) が提案したモデルは、ファージ粒子と生成項（単位時間当たりのバクテリオファージ粒子の遊離）および吸着または崩壊速度による遊離バクテリオファージの損失のバランスをとる点で一致しています。これらのモデルは、その単純さと吸着速度、バーストサイズ、待ち時間などの標準ファージ増殖パラメータの使用により有用で、バッチ生産プロセスのシミュレーションに素早く対応できますが、耐性菌集団や時間の経過によるファージの進化などのプロセスには適合しませんでした。 また、これらのモデルは、バーストサイズや潜伏期間などのパラメータの影響を過小評価する傾向があるが、最近のモデルでは、これらのパラメータの重要性と、それらが他の要因によってどのように変化し得るかが示されている（Santosら、2014；Nabergojら、2018b）＜2845＞＜5151＞Santosら（2014）が最近提案した興味深いモデルは、ファージ吸着定数に細菌の成長速度が与える影響と潜伏期間の値を規定する正規分布式と、これらのパラメータにおける変動性を考慮したものである。 このモデルは、ファージ生産における基質の影響を評価する機会を提供し、細菌増殖速度をモデルに含めることで、プロセス中の細菌の生理学的状態を考慮する間接的なツールを提供するため、非常に有用であることが証明されています。 バクテリオファージ感染パラメータの細菌増殖速度への依存性は、後に他の著者によっても検討された（Krysiak-Baltynら、2018；Nabergojら、, 2018b）；Nabergojらは、バーストサイズは細菌増殖速度に比例して増加し、吸着定数と潜伏期間は減少することを見出した＜2845＞＜5151＞他のモデルは、複数の細菌種の影響、および細菌抵抗性の発生を探求した（Levinら、1977；Santosら、2014；Chaudhryら、2018）。 これらの研究の目的は、必ずしもファージ生産の方法を開発することではありませんでしたが、プロセス中に発生し得るよりも潜在的な状況を説明するために有用です。 これらのモデルには、細菌集団の関数としての細菌の耐性選択および復帰率に関連する変数（時間と共により少ないまたはより多くの感受性細菌の利用可能性）、感受性および耐性細菌が共存できる条件の定義、例えば耐性細菌における強い選択的不利（例えば低い成長率）、および／またはファージが細菌に感染できない（それ以下）空間避難場所（または密度避難場所）の存在、が含まれる。 Chaudhryら（2018）は、ファージが耐性菌に支配された集団で持続する方法について興味深い説明を行い、後者がファージの複製を可能にする頻度で感受性菌を生成し得ることを示唆した。 興味深いことに、この現象は以前にも示唆されています（Bastías et al.） ファージ生産システムにおけるファージ耐性株の生成は懸念すべきことであり、したがって、この可能性を最小限に抑えるために、新しい手法の開発に含める必要がある。 複数の著者が、この問題は、次のセクションで説明するファージ生産セットアップで回避できることを示唆している

別の興味深い研究は、Krysiak-Baltynら（2018）のもので、これも細菌増殖速度の関数として可変感染パラメータを組み込み、シミュレーションした2段階プロセスシステムにおける運用コストと生産性を推定している。 この理論研究の重要な結論の1つは、細菌の増殖に最適な基質濃度は、バクテリオファージの生産にも必ずしも同じではないはずであり、彼らの分析によると、4×1010ファージ/mLの濃度でのファージ1mLあたりのコストは$ 1.78 × 10-2と低くなる可能性があることです。 この推定を実験的に検証し、異なる経済や国にどのように適応するかを決定することは興味深いことです。

最後に、ファージは時間とともに細菌に感染する効率が増加または減少するかもしれないので（Lenski and Levin, 1985）、生産プロセスにおいてバクテリオファージの進化も考慮する必要があります。 この概念は、宿主範囲実験における感染率として表すことができ、宿主範囲拡大のための方法さえも、ファージ療法への応用のために達成することができる（Mapes et al.、2016）。 この状況はバッチ培養でシミュレーションされ、ファージ変異体の出現がファージの遺伝的柔軟性（変異の割合）に強く依存することが示されている（Levin and Bull, 2004）。 生産中のファージの進化を予測することができれば、ファージの溶菌特性を変化させる確率を最小限に抑えた生産プロセスを設定するのに役立つと思われる。

Experimental Experiences in Bacteriophage Production

ファージ生産に関するいくつかの実践的な研究がある。 バイオリアクターでのファージ生産に焦点を当てたものもあれば、プロセスの評価と最適化に焦点を当てたものもある。 やはり、これらの経験では、フラスコやバイオリアクターでの菌の増殖とファージの感染・増殖のステップも考慮されている（表2）。 このデータは、特定のモデルの宿主-バクテリオファージがどのように増殖し、ファージ生産レベルを向上させることができるかについての洞察を与えるのに有用である。 最も多く用いられている宿主-ファージ系は大腸菌とそのファージであり、おそらくこれらの菌-ファージ系（大腸菌ファージT3、T4、T7）に関する情報が多く、他の菌-ファージ系に関する情報が不足しているためと思われる。

表2

ある報告事例によると、得られた力価は、バッチバイオリアクター（5L）において1.2×1016PFU mL-1と高くなることがある（Sochocka et al.、2015）。 このレベルは、精製ステップ、ファージの崩壊速度、および安定性または保存期間を考慮すると、治療目的に必要な生産量（＜5767＞1 1010 PFU mL-1）と一致する（Naghizadehら、2018年）。 他の著者も、1.2Lで5×1012PFU mL-1（Warnerら、2014）、および1Lで2.4×1013PFU day-1（Nabergojら、2018a；表2）という有望なレベルの生産を報告している＜2845＞＜5151＞異なる培養手順および異なるホスト-バクテリオファージシステムを用いているので、いずれの方法がより効率的となることができるかについての比較の確立が困難である。 バッチ培養は、バクテリオファージを生産する最も安価な（最も単純ではない）方法であるが、利用可能な装置の最大容量、合計操作時間、基質の利用可能性（高濃度は細菌の増殖に阻害的となりうる）によって大きく制限される。 連続培養は、入口と出口のフラックス変更によりバクテリアの希釈率を最適化することで、より高いスケーラビリティを実現する。 その上、希釈率を調整することで、バーストサイズ、吸着定数、潜伏期間などの感染パラメータに直接影響を与える細菌増殖速度を直接制御することができます（Mancusoら、2018；Nabergojら、2018b）。 希釈率は、Nabergojら（2018a）によって示されたように、1 Lセルスタットシステムにおいて2 h-1という低い希釈率で109ファージmL-1 h-1の最大ファージ生産性が達成されたように、システムの生産性を高めるために使用することもできる。 連続運転システムは恒久的に稼働させることができるため、企業にとって最も便利なバイオテクノロジー製品の生産方法である。 しかし、定常状態を維持するために常に監視する必要があり、導入が困難でコストがかかる。 細菌の増殖とバクテリオファージ生産のための完全に連続的なプロセスは、特定の対策が採用されない場合、バクテリオファージ耐性発生の確率を増加させ得る（Middelboeら、2001）

一部の著者は、2段階プロセスの実装を提案しており、1つは細菌の生産専用、もう一つはファージの繁殖のためである（Schwienhorstら、1996；Sauvageau and Cooper、2010；Nabergojら、2018a）。 これは、2つのバイオリアクターが直列に接続され、システム内を一定の流量で流れるセルスタットシステムで実現することができます。 この場合、最大生産性に到達するために、リアクター間の流量と各リアクター内の容積（および添加による希釈率および細菌増殖率）を制御することができます（Nabergoj et al.） SauvageauとCooper（2010）によって提案された別の興味深い設定は、2段階の自己循環プロセスの半連続システムで構成されています。 この場合、各ステージはバッチ培養と同様に機能し、細菌はまずファージとは別に増殖し、適切な濃度に達した時点でファージ増殖ステージに導入されるため、所望の倍数性を用いた感染プロセスの開始を可能にする（Kasman et al.） この方法は、連続的なシステムの定常状態を維持するための常時監視を必要としないという利点もあり、7.59 × 1014 PFU mol CO2-1 という生産性を得るために使用されている (Sauvageau and Cooper, 2010). セルスタットシステムと 2 段階の自己循環プロセスの両方の例は、細菌がファージの非存在下で増殖するため、プロセス中にバクテリオファージ耐性が好まれないという大きな利点がある

最後に、バクテリオファージ生産に関する研究で必ずしも報告されないパラメーターがあることに注意することが重要です。 例えば、バイオリアクターへの曝気割合または空気流入などのパラメータは、これが工業レベルでのバクテリアの生産において最も重要なパラメータの1つであるにもかかわらず、2つの報告（Sauvageau and Cooper, 2010; Santos et al, 2014）においてのみ言及されている。 バクテリオファージ生産におけるエネルギー移動、異なる基質利用、バイオリアクター設計、撹拌、プロペラ、建築材料などの他のパラメータに関する情報は少ないか存在しない。

最終結論

幅広い応用範囲におけるファージの潜在利用の再発見は、非常に刺激的で有望なものである。 その証拠に、バクテリオファージ耐性が発生する確率を低減するバクテリオファージ生産のためのシステム、例えばセルスタットまたは2段階の自己循環プロセスが好ましいとされている。 これらのオプションは、プロセスの生産性を高めるために変数を制御することも可能であろう。 とはいえ、バクテリオファージの生産モデルはまだ確立されておらず、いくつかの点で改善することが可能である。 克服すべき課題もまだ多く残っている。 最適化された大規模なバクテリオファージ生産、インフラおよび設備コスト、さまざまな安全性の懸念、および適用量に関するさらなる研究が必要であり、経験から、これらの課題は学術的および産業的パートナーの共同努力によって直面する必要があることが示唆されている

最後に、バクテリオファージ生産のモデルのほとんどは、ファージ感染および細菌増殖のパラメータの特定の値の範囲で適用できることに留意することが重要である。

著者による貢献

RG、SL、およびRBは研究を考案し、原稿を書いた。 KG、GH、JRは原稿の各セクションを執筆した。 すべての著者は、文献の改訂、原稿の改訂に貢献し、投稿されたバージョンを読み、承認した。

資金調達

この研究は、CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133およびPostdoctorado PUCV 2018によって資金提供されました。

利益相反声明

著者らは、本研究が利益相反の可能性と解釈される商業的または金銭的関係がない状態で行われたことを宣言する

Acknowledgegments

RGはCONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133を評価した。 SL thanks Postdoctorado PUCV 2018.