HIV-1 Proteaseに対するいくつかの4-Hydroxycoumarin誘導体の合成と阻害活性

Abstract

6種の新規4-hydroxycoumarin誘導体を合理的に合成し，結晶HIV-1 proteaseを用いて分子ドッキングにより検証し特性を明らかにした． 分子ドッキングの結果，(7)と(10)は抗プロテアーゼ活性を有することが予測された。 HIV-1 プロテアーゼと水素結合を形成する最も重要な官能基は、ピラン酸素、原子、ラクトンカルボニル酸素および水酸基の一つであった。 新たに合成した化合物について，MT-4細胞を用いたHIV-1複製阻害試験を行い，MTT試験における細胞生存率で測定したHIVの細胞障害性効果からの細胞の保護について検討した。 その結果，誘導体-7 は最大無毒性濃度（1 mM）よりもはるかに低い IC50=0.01 nM で 76-78% のウイルス感染阻害を示した． 7の抗プロテアーゼ活性は2種類の濃度で25%であった。 しかし，(7)の研究結果は，これをファーマコフォアとして，さらなる合成と抗HIV活性の評価に利用することを推奨するものである． はじめに

ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のレトロウイルスプロテアーゼ（PR）は、ウイルス複製のための重要な酵素の1つである。 タンパク質や糖タンパク質の前駆体を切断し、活性なウイルス酵素や構造タンパク質を生成する。 不活性なHIV-1 PRは、非感染性ウイルスにつながる。 この事実は、HIV-1の複製を阻害する強力な抗プロテアーゼ活性を持つ物質の探索を刺激した。 過去12年間、多くのペプチド類似体であるHIV-1 PR阻害剤（PI）が臨床導入されましたが、その大部分は、経口バイオアベイラビリティが悪く、クリアランスが速く、忍容性に問題があり、しばしばリポディストロフィーや脂質異常症を伴うなど、薬理学的特性が劣るものでした 。 また、ペプチドミメティクスであるため、PIが上市される前のグループの薬剤を使用しても、すぐに高い耐性や交差耐性を示す。

Tipranavir や Darunavir などの新しい非ペプチド性PIの開発は、PI耐性変異体に素晴らしい効力を示し、そのような耐性を持つ患者の重要な選択肢として残っている。 このため、HIV-1プロテアーゼを阻害する新規の非ペプチド性物質が求められている。 非ペプチド性物質である4-ヒドロキシクマリン（図1）および4-ヒドロキシピラン誘導体がHIV-1 PRを阻害する実験データは、この考えを支持するものである。

長年、4-ヒドロキシクマリン誘導体のような非ペプチド性物質の合成と評価に興味を持ち、これらの実験を拡張するように勧められました。 ここでは、新規な4-ヒドロキシクマリン誘導体の合成と、結晶酵素を用いた分子ドッキング実験、生物活性評価について紹介する。

2. 結果と考察

2.1. 4-ヒドロキシクマリン誘導体の合成＜685＞＜5175＞2.1.1. アリールメチレン-β-ケトエステルの合成

アリールメチレン-β-ケトエステルの合成には、置換度の異なる芳香族アルデヒドを用い、ピペリジンと氷酢酸の存在下で酢酸エチルとのクノイエナゲル反応により合成したものを使用した。 これらのアリールメチレン-β-ケトエステルは、図2のように表示することができる。

図2

4-ヒドロキシベンズアルデヒドと2,4-ペンタンジオンの反応も上記と同じ条件で行った。 単離された生成物は 3-(4-hydroxy)phenylmethylene-2,4-pentanedione (6) 、図3参照。

2.1.2. アリルメチレン-β-ケトエステル及びアリルメチレン-2，4-ペンタンジオンの4-ヒドロキシクマリンへのマイケル付加反応

反応の第2段階は、ナトリウムメトキシド又はピペリジンを基本剤として、マイケル反応により得られたアリルメチレン-β-ケトエステルと4-ヒドロキシクマリンの付加反応を行うことである． この反応は図4のように表現できる。

2.2. Molecular Docking

新たに合成したいくつかの4-hydroxycoumarin誘導体とHIV-1プロテアーゼの分子ドッキングによる相互作用を検討した。 比較のためにいくつかの4-hydroxycoumarinの活性の実験データを使用した。

この方法で、𝐺スコアとE-model関数の値が得られた。 これらはスコアリング関数と呼ばれ、Δ𝐺bindの抽象的な等価値である。 これらの関数は、溶媒効果による自由エネルギー、タンパク質とリガンドのコンフォメーション変化、タンパク質とリガンド間の相互作用（水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス力）、タンパク質とリガンドの内部回転の凍結による自由エネルギー損失、2分子の会合による並進・回転エネルギーの損失、振動モードの変化による自由エネルギー（通常無視）などが考慮されている。 これらの値があるリガンドでより負であれば、このリガンドの結合能が優れていることを意味する。 リガンドが1つの決定されたコンフォメーションで結合能力を示すとき、プログラムはこれを「良いポーズ」として表示する。

この酵素は2本のポリペプチド鎖からなり、活性部位の底に2つのアスパラギン酸残基を持つアスパルチルプロテアーゼファミリーである。 Protein Data Bankのペプチド模倣阻害剤BEA369（pdb code 1EBY）と結合したレトロウイルスHIV-1プロテアーゼの結晶構造図を用いた。

リガンド（1）〜（5）について、試験化合物群の分子ドッキングによる𝐺スコアとEモデル値を表2に示す。

調査した4-ヒドロキシクマリン誘導体と酵素HIV-1プロテアーゼの活性部位間の相互関係は、水素結合とファンデルワールス相互作用で実現している。 例えば、配位子(1)〜(4)によれば、最も結合活性の高い化合物は化合物(10)である（スコアリング関数の値による）。 この事実は、ピラン酸素原子、ラクトンカルボニル酸素、および芳香環に側鎖から結合した水酸基の1つ（メタポジション中）の間に水素結合が形成されることに起因すると考えられる。 また、ファンデルワールス力も良好な結合に寄与している。 配位子(5)によれば、最も活性が高いのは化合物(7)である。 化合物 (7) には、ピラン酸素原子、ラクトン環のカルボニル酸素原子、および対応するタンパク質断片が関与して、2つの水素結合が存在する。 また、m-ニトロ基とその酸素原子が関与するファンデルワールス相互作用が結合に大きく関与していると考えられる。 化合物(7)は実験的なリガンドよりも活性が高いようである。 細胞培養における生物活性（MT-4細胞）

分子ドッキング実験において、いくつかの4-ヒドロキシクマリン誘導体の単離HIV-PRに対する活性を示した後、さらにHIV-1に感染したMT-4細胞でテストすることは興味あることであろう。 抗HIV効果の評価は，感染のエンドポイントとしてバイタル色素（MTT）の取り込みによる細胞溶解定量に基づくin vitro迅速かつ高感度マイクロタイター感染アッセイによって行われた 。 さらに、HIV-1 III B感染MT-4上清の内因性逆転写酵素（RT）活性に対する阻害剤の効果を、HIV-1複製阻止能力の指標として検討した。 MT-4細胞を各阻害剤で感染させ72〜96時間インキュベートした後、HS-Lenti Kit-RT assay (Cavidi, Sweden) のガイドラインに従って細胞上清のRT活性を測定した。 また，新たに合成した4-ヒドロキシクマリン類の外来性組換えRT（rRT）に対する直接作用の検討も行った． さらに、すべての化合物は、抗HIV-1 PR活性について試験された。 表3は、MTTを用いたマイクロタイター感染アッセイとHIV-1 PR活性の阻害の結果を表している。 実験は、各化合物の最大無毒性濃度（MNC）で行った。

まず、化合物（8）、（7）、（12）は、他の3つの化合物よりも細胞毒性が高いことを意味する高いMNCを有することが分かる。 また，(10)と(7)はMT-4細胞のウイルス複製を阻害したが，(7)の阻害率は78%と顕著であった。 10倍希釈したウイルスを用いて，IC50は0.01 nMであった． また，内因性，外因性ともにRTに作用する化合物はなかった． これは、RTが抗ウイルス作用の標的でないことを意味する。 分子ドッキングの結果から予想されるように，HIV-1 PR活性は（7）で24〜25％阻害された（5回に分けて評価）． 感染阻害（約75％）とプロテアーゼ活性（25％）に関するデータ間の（7）の不一致は、抗インテグラーゼのような別の活性によって説明される可能性がある。 いくつかの4-ヒドロキシクマリン誘導体がインテグラーゼ阻害剤であることはよく知られている。

3 まとめ

2段階合成により6種の4-hydroxycoumarin化合物を合成することができた。 第一段階は芳香族アルデヒドとアセト酢酸エチルまたはアセチルアセトンとのKnoevenagel反応であり、第二段階は芳香族アルデヒドとアセト酢酸エチルまたはアセチルアセトンとのKnoevenagel反応である。 第二段階は、得られたアリールメチレン-β-ケトエステルまたはアリールメチレン-2,4-ペンタンジオンと4-ヒドロキシクマリンとのマイケル付加反応である。 生成物は1H NMR、EI-MS、FTIR、元素分析により同定し、特徴を明らかにした。

HIV-1 PRに対する結合活性を分子ドッキングにより検討した。 ペプチド模倣阻害剤BEA369と結合したHIV-1 PRの結晶を使用した。 最も高い結合活性を示したのは、実験リガンド（1）、（2）、（3）、（4）によると化合物（10）、リガンド5によると化合物（7）であった。 この事実は、ピラン酸素原子、ラクトンカルボニル酸素、および芳香環に側鎖から結合した水酸基の1つ（メタポジション）の間に水素結合が形成されたためと思われる。 また、ファンデルワールス引力も良好な結合に寄与している。

6つの化合物すべてについて、HIV-1に感染したMT4細胞で抗HIV-1 PR活性を試験した。 MTTテストにより細胞生存率を評価し、さらにHIV-1 PR阻害率を測定した。 最も高いHIV-1 PR阻害率（25％）および最も高いMT4細胞生存率（78％）は、化合物（7）で示された。 この化合物(7)をファーマコフォアとして、HIV-1 PRに対してより活性の高い誘導体を新たに合成することが期待できる。 4-Hydroxycoumarin誘導体の合成

4.1.1. Materials and Methods

すべての出発物質はMerck, Sigma-Aldrich, Flukaから購入した。 これらは、さらに精製することなく使用されます。 融点はBüchi 535融点測定装置でオープンキャピラリーチューブで測定した。 IRスペクトルは、島津FT-IR 8101 M分光器でνjolで記録し、周波数はcm-1で表した。 1H NMR スペクトルは Brucker 250 MHz で DMSO-d6 またはアセトンで TMS を内部標準として記録した（化学シフトは ppm 単位、結合定数 (𝐽)は Hz 単位で報告されている）。 略号は以下の通り：s: singlet, d: doublet, dd: double doublet, dq: double quartet, dqui: double quintet, t: triplet, m: multiplet.

Mass-spectral analysis was performed by electron ionization on masspectrometer Hewlett-Packard 5973 at 70 eV.

4.1.2. アリールメチレン-β-ケトエステルの調製のための一般的手順

等モル量の芳香族アルデヒドおよびエチルアセトアセテートを丸底フラスコ中で混合する。 ピペリジン (0.03 mol) と氷酢酸 (0.04 mol) もこの反応混合物に加える。 後者を室温で90分間攪拌する。 20 mL のエーテルおよび/または 150 mL の蒸留水を反応混合物に加えた後、異なる色の結晶が形成される。 これらの結晶を濾過し、洗浄する。 その後、室温で乾燥し、適当な溶媒（主にアルコール類（エタノール、プロパノール、2-プロパノール）および水）で再結晶させる。

4.1.3. 3-（4-ヒドロキシ）-フェニルメチレン-2，4-ペンタンジオン（6）の調製手順

4-Hydroxybenzaldehyde (3.66 g, 0.03 mol) とアセチルアセトン (5.14 mL, 0.05 mol) を丸底フラスコに入れ混合した後、3-Hydroxybenzaldehyde を加える。 ピペリジン (0.03 mol) および氷酢酸 (0.04 mol) も反応混合物に添加する。 後者を室温で120分間攪拌する。 その後、蒸留水 150 mL を加える。 異なる色を持つ結晶が形成される。 これらの結晶を濾過し、洗浄する。 その後、室温で乾燥させ、塩化メチレンで再結晶させる。

4.1.4. 4-ヒドロキシクマリンとの縮合物の調製のための一般的手順

前の反応で得られたアリールデン-β-ケトエステルと4-ヒドロキシクマリンを25〜30mLのメタノール（溶媒として使用）中で等モルの量で混合する。 塩基性物質としてナトリウムメトキシド (0.003 mol) も試薬に添加する。 反応混合物を還流下で60時間煮沸攪拌する。 反応はTLC（ヘキサン：アセトン＝2：1またはヘキサン：アセトン：クロロホルム：メタノール＝5：3：2：1）で制御する。 試薬の量が枯渇したとき、加熱を停止した。 反応混合物の残渣を濾過し、熱水で洗浄することにより、反応しなかった4-ヒドロキシクマリンまで除去した。 その後、残渣を室温で乾燥し、適当な溶媒（メタノール、エタノール、2-プロパノール）中で再結晶する。

4.1.5. 3-（4-ヒドロキシベンジリデン）-2，4-ペンタンジオン（SS-23）と4-ヒドロキシクマリ

3-(4-Hydroxybenzylidene)-2,4-pentanedione (1.02 g, 0.005 mol) and 4-Hydroxycoumarin (0.81 g, 0.005 mol) is mixed in slight excess of 4-hydroxycoumarin in 15-25 mL methanol.The Michael Addition between three-Hydroxybenzylidene (SS-23) and 4-Hydroxycoumaría 3-Hydroxybenzileisen -2,4-Pentanedine (1.02 g, 0.005 mol)及び4-ヒドロキシクマリン (0.81 g, 0.005 mol). 塩基性物質としてピペリジン (0.003 mol) も試薬に添加する。 反応混合物を還流下で60時間煮沸攪拌する。 反応はTLC（ヘキサン：クロロホルム：酢酸＝10：10：4、ヘキサン：クロロホルム：酢酸＝10：10：2、ヘキサン：アセトン＝2：1）で制御する。 試薬の量が少なくなった時点で加熱を停止した。 反応混合物の残渣を濾過し、反応しなかった4-ヒドロキシクマリンを除去するために、熱水で洗浄した。 その後、残渣を室温で乾燥し、アセトンで再結晶する

4.2. 分子ドッキング

すべての分子ドッキング計算は、SchrodingerパッケージのMaestro Macromodel Glideプログラムによって行われた。 すべての構造（実験的に検証されたものと新しいもの）は、OPLS2005力場と5000反復を使用して、Macromodelプログラムによって最小化されています。 HIV-1プロテアーゼと阻害剤BEA369のX線構造は、Protein Data BankからPDBコード1EBY.

4.3 で取得しています。 細胞株およびウイルス

MT-4-a ヒトリンパ芽球様懸濁細胞株、Gianfranco Pancino- Institute Pasteur, (Unite de Regulation des Infections Retrovirales, Paris, France) から好意的に提供され、HIV-1 III B株による実験的生産感染の古典モデルを表し、細胞培養における推定HIV阻害薬の効果の研究のための日常標的として使用されている。

研究対象の化合物をまずDMSOに溶解し、胎児血清を含まない細胞増殖培地でさらに希釈した。 溶液はすべて臨時で調製した。

次のパラメータを研究した：細胞毒性濃度50-CC50（可能であればMT-2細胞の50％の死を防ぐ濃度）、最大無毒性濃度-MNC、阻害濃度50-IC50（ウイルスの複製を50％阻害する濃度）。 CC50とMNCはMTT uptake assayで検出した。 IC50はMT-4細胞を用い，MTT testによりHIVの細胞障害作用からの細胞保護作用を検討した． 急性感染条件下での実験は、96ウェルマイクロプレートで6-8パラレル/実験にて実施した。 細胞コントロール（培地のみのMT-4細胞）およびウイルスコントロール（ウイルス感染MT-4細胞）は、各実験で実行された。 アンチウイルスアッセイでは、細胞コントロール以外の各ウェルにHIVを感染多重度が0.1になるように添加した。 ウイルスの付着は37℃/5% CO2で1時間行った。 プレートを37℃/5% CO2で72-96時間インキュベートした。 その後、MTT試験を記載通りに行い、A540 nmで生細胞の吸光度を比色測定した。 すべての実験について、各カラムの平均値を算出した（A540の値が±10%で異ならない場合のみ）。 抗ウイルスアッセイについては、実験列と対照列の平均値を比較し、適切な濃度の物質の下で保護された細胞の割合（細胞生存率）を物質の濃度に対してプロットし、IC50を得た。 細胞生存率（細胞保護率）は、以下の式に従って算出した：=%cellprotectionA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControl-A540ControlHIV×100、(1) ここで𝑋は、研究対象の化合物の適切な濃度で処理したHIV感染細胞のA540の平均値、コントロールHIVは化合物を添加していないHIV感染細胞のA540の平均、セルコントロールは感染せず阻害剤の処理も受けていない細胞のA540の平均値である。

参考物質として、ABC（Abacavir well-known nucleoside reverse transcriptase inhibitor-NRTI）及びpepstatinを使用した

4.4.1. 内因性RT活性と化合物のRTに対する直接効果

HS-Lentiキット-RTアッセイ（Cavidi, Sweden）によりテストした。 このキットには標準としてリコンビナントRT（rRT）が含まれており、RTの定量が可能である。 内因性RTアッセイでは、HIV-1感染/非感染MT-4細胞の上清を化合物とのインキュベーション後/非インキュベーション後に、メーカーのガイドラインに従って試験した。 上清中のRT活性は、各キットに含まれるHIV-1 rRT標準品から算出した（単位：pg/mL）。 また、RT活性に対する化合物の直接効果を同じキットで測定し、RTが抗ウイルス作用の標的であることを証明することを目的とした。 阻害剤の適切な段階希釈液をコントロールバッファーで調製し、反応混合物に添加した。 標準希釈液のRT活性を、化合物を添加したもの、またはコントロール（化合物を添加しないインキュベーション混合物のみを添加したもの）と比較し、33℃、3時間反応させた。

4.4.2. ネイティブウイルスPRを用いた試験による抗プロテアーゼ活性の検出

Brogliaら、2006によって先に記載された組換えプロテアーゼ活性の検出方法を、ネイティブウイルスプロテアーゼを用いるように修正した。 HIV-1プロテアーゼのソースとして、慢性感染したH9/HTLV IIIB細胞上清の濃縮ウイルスストック（50x）の再懸濁液を使用した。 リン酸緩衝液に2.5% Triton X-100を含む溶解用緩衝液を用いて、ウイルス粒子の溶解と活性酵素（プロテアーゼ）の遊離を行った。 ウイルスを含む組織培養液の濃縮は、Biofuge Stratos, Heraeusを用い、4℃、35000 rev/minで1時間、超遠心分離することにより行われた。 ペレットを再懸濁し、破砕バッファーで50倍濃縮液を得た。

各実験で以下の反応混合物を調製した：1000 𝜇Lリン酸緩衝液（20 mM, pH 6.0）； DMSO中の20𝜇L HIVプロテアーゼ基質III（1𝜇g/mL, 760𝜇M; Bachem, Switzerland）、臨時調製；25𝜇L破壊（lysis）バッファ＋100μL HIVストックを含む溶液から取った20μL酵素（HIVストック）、実験前に37℃で40分インキュベートされた。

HIV-1PR活性は、T80＋UV-Vis分光光度計（PG instruments）を用い、室温、1cm光路長で、300nmの酵素反応基質利用率を直接分光光度法で読み取ることにより、測定した。 酵素活性（ウイルス濃度）を変化させ、初期反応速度（V0）が0.0020〜0.0030 ΔAbs/minとなるように調整した。 被検化合物および参照阻害剤（ここではペプスタチン）を酵素の前に反応混合物に加え、阻害作用のスクリーニングを行った。 被検化合物を添加しない場合と比較して、反応速度が50％低下する被検化合物の濃度をIC50と定義した。