Vector: pFB-LIC-Bse
Cell line.AASS-SDH
Protein expression, purification and assay procedures of hAASS-SDH
Verctions: DH10Bac
タグと付加物。 N末端、TEVプロテアーゼ切断可能なヘキサヒスチジンタグ
タンパク質配列を構築する。
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
（下線はベクターにコードされたHis-.タグとTEVプロテアーゼ切断部位*）
採取した細胞を溶解バッファ（50mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 20 mM Imidazole pH 7.4, 0.5 mM TCEP, 1 μL per 1 mL protease inhibitor cocktail EDTA-free).
細胞ペレットを約200 mLの溶解バッファに溶かし、12000 psiで2パスによる均質化によって破砕した。 細胞破片は35000 x g, 1時間でペレット化し、上清はグラビティフローNi-NTAカラム（5 mL）での精製に用いた。
用いたバッファーは以下に詳述する；
Binding Buffer: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 20 mM Imidazole pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Wash Buffer(洗浄液): 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 40 mM Imidazole pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Elution Buffer(溶出液): 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 250 mM Imidazole pH 7.4, 0.5 mM TCEP
清澄した細胞抽出液を溶解バッファであらかじめ平衡化したNi-NTA樹脂5mlに加え、ガラスカラムに通過させました。 その後、Binding Buffer (2 x 50 mL) と Wash Buffer (2 x 50 mL) でカラムを洗浄した。 タンパク質をElution Bufferで5 x 5 mLのフラクションで溶出した。 カラム1からの溶出画分をプールし、30 kDa MWCOスピン濃縮器で5 mLに濃縮し、S200 16/60カラム（GF Buffer（50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 5% Glycerol）で予め平衡化）に 1.0 mL/min で注入した。 1.5 mL-フラクションを回収した。 溶出したタンパク質は、TEVプロテアーゼ（1/20 (w/w)）により4℃で一晩切断された。 翌日、GFバッファで平衡化した0.5 ml Ni-sepharose カラムにタンパク質試料をロードし、未切断タンパク質を除去した。 プールしたタンパク質画分を30 kDa mwco concentratorを用いて13 mg/mLに濃縮した。
活性測定とスクリーニング
hAASSのSDH活性は、NAD+がNADHに還元されると340 nmの光で励起され、還元型NADHが蛍光を発することを利用して追跡して測定された。 アッセイを384ウェルフォーマットに採用し、PheraStar蛍光リーダー（BMG Labtech社製）を用いて検出した（Excitation/Emission = 340/480 nm）。 このアッセイでは、150 nM までのタンパク質濃度で直線的な応答が得られた。 典型的な反応は、100 nMの精製酵素、0.2 mMのNAD+、1.3 mMのサッカロピンで構成される。 反応バッファーは25 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% CHAPSからなる。 化合物ライブラリ（LOPAC（Sigma）およびNIH Clinical Collections I&II）は、20μM化合物濃度で社内でスクリーニングした。
示差走査蛍光測定
DSFは、Mx3005p RT-PCR machine（Stratagene）を用い、励起および放出フィルターをそれぞれ492 nmおよび610 nmとして、96穴プレートで実施した。 各ウェルには、2 µM DSF バッファー (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.5) 中のタンパク質 2 µL、メーカーストック (Invitrogen) から DSF バッファーで 1000 倍希釈した SYPRO ORANGE 2 µL、（必要に応じて）各濃度でのリガンド2 µL が含まれた。 蛍光強度は25℃から96℃まで3℃/分のランプレートで測定した。
結晶化
Apo結晶は50nLのhAASS-SDHタンパク質（80mg/mL）を、20% PEG3350、0.1M Tris pH7.5および0.2-0.33M malonateナトリウムを含む100nLリザーバー溶液と混合することによって調製した。 NAD+結合結晶は、100 nLのhAASS-SDH（18 mg/mL、NAD+のモル過剰）を、25% PEG3350, 0.2M NaCl および 0.1M tris pH 8.5 を含む50 nL のリザーバー溶液と混合することによって調製された。 結晶は9%ブタンジオールで凍結保護した後、液体窒素で凍結した。 フラグメントスクリーニングキャンペーンでは、8%ブタンジオール添加の結晶化溶液に化合物（10/50/500 mM）を5-30分間浸漬し、液体窒素で凍結した。
構造決定手順
hAASS-SDHのアポとNAD+結合結晶は異なるスペースグループ（P43212 vs P212121）に属していることがわかった。 hAASS-SDHの構造は、S.cerevisiaeの菌類サッカロピン還元酵素（PDB code 2AXQ）を検索モデルとして、PHASERプログラムによる分子置換法で解いた（配列同一性38％）。 非対称ユニット(a.u.)に2つの分子が見いだされた。 初期モデルはphenix.autobuildを使用して再構築されました。 活性部位に結合したNAD+分子を差分フーリエ法で同定し、Cootを使って電子密度に手動で配置しました。 モデルを完成させるために、TLS精密化を含むphenix.refineの反復サイクルと、Cootを用いた欠損残基の手動モデル構築が行われました。 a.u.の2つのコピーのドメインIII (res 278-376)のコンフォメーションの違いにより、NCS拘束は適用されませんでした。溶媒原子は、phenix.refineを用いた最後の4ラウンドの洗練の間に配置されました。 フラグメントスクリーニングキャンペーンでは、差分密度マップを用いたDIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) によりリガンドを同定した。 低占有率の弱い結合体は、PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/) を用いて評価しました。これは、統計モデルに基づいて、あるデータセットに存在するリガンド密度のうち、大多数のデータセットに存在しないものを見つけるためのものです。 すべてのデータセットの座標と構造因子は、RCSBタンパク質データバンクに寄託されている。 データ収集と精密化の統計はPDBのページから入手できます。
市販の試薬
CRISPR/Cas9 knockout plasmids
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript.Inc: Cat # 10157
に記載されています。