The coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a infectious disease that have caused global pandemic with more 36 million infected persons from approximately 200 countries or territories.The Covinivirus team of the Covinivirus disease 2019 (COVID-19) は、世界的な流行となっている感染症である。 であり、現在までに100万人以上が死亡しています（世界保健機関（WHO）、2020年）。 COVID-19の原因物質である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、コウモリ媒介のコロナウイルスRaTG13が現在までに最も近い遺伝的親類であることから、コウモリが起源であると推測されています（Andersenら、2020; Zhouら、2020）。 いくつかの種が中間宿主としての潜在的な役割を決定するために研究されている（Shi et al.、2020）。 さらに、COVID-19に類似した疾患を再現する動物モデルは主要な研究ラインと考えられており、治療薬や予防薬の開発に必要である。
SARS-CoV-2に感受性のある潜在的な動物種を提案するいくつかのモデル研究（Damasら、2020；Qiuら、2020；Veljkovicら、2020）のほか、複数の実験感染によってすでに幅広い感受性動物が示されている。 具体的には、エジプトフルーツバット、フェレット、ゴールデンシリアハムスター、猫、ヒト化アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）を発現するマウス、BALB／cマウス（数回の細胞培養継代による変異SARS-CoV-2を使用）およびいくつかのヒト以外の霊長類はウイルス感染に寛容で、不顕性から軽～中程度の呼吸器疾患を発症する（Bao et al, 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020)。 実験的観点から、接種された動物は部分的にセロコンバージョンすることができるので、SARS-CoV-2に対する犬の感受性は限られている（Shi et al.、2020）。 一方、ニワトリ、アヒル、ブタの鼻腔内接種では、感染の証拠は得られなかった（Schlottau et al, 2020; Shi et al, 2020）。
豚は、解剖学、遺伝学、生理学、そして免疫学の面でヒトと類似性が存在するため、研究においてよく使用されている。 実際、ブタでの実験は、げっ歯類での実験よりも、ヒトでの治療や予防治療の予測に役立つ可能性が高い（Meurensら、2012）。 しかし、ブタは鼻腔内接種ではSARS-CoV-2感染に感受性がないため（Schlottauら, 2020; Shiら, 2020）、他の接種経路を用いてこのウイルスによるブタ感染モデルを開発する可能性は調査に値する。 ブタを試験対象とする主な根拠は、（ヒトACE2を構成的に発現しない）HeLa細胞にブタのACE2をトランスフェクトすることによってこの種のACE2受容体が機能すること（Zhouら、2020）、またはSARS-CoV-2のSタンパク質を有する疑似粒子がブタ腎細胞に感染することができること（Letkoら、2020）である。 さらに、ACE2タンパク質は、免疫組織化学で評価すると、ブタのすべての主要な組織で発現している（Xiao et al.、2020）。 結果として、推定COVID-19ブタモデルを設定するために、我々は家畜ブタ（Sus scrofa domesticus）における異なる自然および非自然経路のSARS-CoV-2接種の影響を調査した。
そのために、5～6週齢の在来豚（Landrace × Large White）5頭を4群選択し、異なる経路により接種した：鼻腔内（IN、1.5ml／鼻孔；総容量3ml）、気管内（IT、3ml）既報（Garcia-Morante et al, 2016）、筋肉内（IM、首筋の両側に1 ml；総容量2 ml）または静脈内（IV、2 ml）で、各動物あたりSARS-CoV-2分離株（GISAID ID EPI_ISL_510689）の組織培養感染用量（TCID50）の最終投与量を105.8個とすることができる。 IT群およびIV群には、接種前にケタミン10mg/kgおよびキシラジン0.8mg/kgで麻酔をかけた。 他のコロナウイルスと同じプロトコルに従って、Vero E6細胞（ATCC CRL-1586）において継代2 SARS-CoV-2を増殖させ滴定した（Rodonら、2019年）。 2匹の余分な豚を陰性対照として使用した。
市販のELISA（INgezim Corona Diferencial 2.0 ）により決定したところ、すべての動物が豚呼吸器コロナウイルスに対して血清陽性であった。 α-コロナウイルスとβ-コロナウイルス間の抗体交差反応性が記載されていないことを考慮し（Okba et al.、2020）、動物を試験にとどめた。 このウイルスはヨーロッパの豚の家畜に遍在しているため、PRCVに対する初期反応性が期待された（Saifら、2012；Vidalら、2019）。
動物実験は、Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries（CEEA-IRTA）のInstitutional Animal Welfare Committeeおよびカタルーニャ自治政府の動物実験倫理委員会の承認を受け、認定されたスタッフによって実施された。 SARS-CoV-2の実験は、IRTA-CReSA（スペイン、バルセロナ）のバイオコンテインメント・ユニットのバイオセーフティ・レベル3（BSL-3）の設備で行われた。
接種後（dpi）2日および22日に、それぞれ2および3匹／グループ（IT、IMおよびIV）が安楽死させられた。 IN接種がSARS-CoV-2感染を引き起こすのに非有効であることが既に実証されているので（Shiら、2020）、この経路で接種したブタを、組織における可能な一過性の初期感染の証拠を評価するために、1日目と2piに安楽死させた。 陰性対照動物は、実験開始前に安楽死させた。 サンプルは、以前に記載されたように収集され、処理された（Vergara-Alertら、2017）。 簡潔に言えば、完全な剖検をすべての動物で実施した。 いくつかの組織（前頭部、内側および尾部水晶体；近位、内側および遠位気管；大および小気管支、左頭蓋、内側背面および尾部肺領域；腎臓；肝臓；心臓；および脾臓）を採取し、10％中性緩衝ホルマリンに浸漬して固定し、パラフィンに埋め込んで3μmで切開してスライドを調製した。 組織スライドはヘマトキシリン・エオジン（HE）染色し、潜在的な顕微鏡的病変を評価した。 そのほか、RT-qPCRによるSARS-CoV-2 upE遺伝子検出を行うために、同じ組織に加えて回腸、頸部リンパ節（LN）、縦隔LN、腸間膜LN、嗅球、扁桃、胸腺、耳下腺唾液腺、副腎、すい臓、脳幹、眼瞼および骨髄もビーズの入ったチューブでDulbeccoの修正イーグル培地（DMEM）に入れて採った（Corman他、2020年）。 鼻腔および直腸スワブも採取し（最初の1週間は毎日、14および22dpi時）、上記のRT-qPCRによってウイルスRNAの存在について分析した。 0日目、14日目、22日目πに採取した血清試料は、社内ELISA（Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020）によりSARS-CoV-2スパイクS1＋S2およびヌクレオカプシド（N）蛋白に対する抗体の存在を検査した。 また、ウイルス中和アッセイは、若干の修正を加えた以前のプロトコルに従って実施した（Rodonら、2020）、血清およびSARS-CoV-2の連続希釈物は、プレートアッセイ性能の前に37℃で1時間インキュベートされた。
すべての動物を毎日モニターしたが、SARS-CoV-2接種後に臨床症状を示したものはなかった。 また、SARS-CoV-2感染に起因する肉眼的または顕微鏡的病変は、対照群と同様にすべての接種群の調査対象動物のいずれにも認められなかった（データは示されていない）
いずれの豚にも、ウイルスRNAの鼻または直腸の排出は認められなかった。 IN接種した1頭の近位気管は、1dpiでウイルスRNAが陽性であった（Cq＝24.36）。 この動物および残りの豚の残りの組織はRT-qPCRで陰性であった（qPCR検出限界38.6サイクル）。
14および22 dpiまでに、スパイクタンパク質に向けられた低レベルの抗体がIMおよびIVグループのすべての動物で検出され得た（図1a）。 さらに、これらのブタは22dpiで中和抗体価も示した（74から317SNT50相互希釈価の範囲）（図1b）。 また、Nタンパク質を標的とする低抗体レベルは、実験終了までにIM接種動物3頭のうち1頭およびIV接種動物のすべてで認められた（データ示さず）。 重要なことは、IT群の1匹の動物が、Sに対する抗体を示さなかったが、0日目のπで中和価（SNT50相互希釈価29）と共にNタンパク質に対する抗体を有しており、これは豚に感染する別のコロナウイルスとの交差反応の可能性を示唆している可能性があることである。 なお、これらのN蛋白質に対する抗体は、実験終了までに減少しており、母体由来のものであることが示唆された。 さらに、この動物は22dpiの時点では血清中和抗体を示さなかった（図1b）。
今回のデータから、SARS-CoV-2は試験したどの経路、すなわちIN、IT、IMおよびIVによっても豚に感染しないことが示された。 したがって、今後のワクチン候補の免疫原性の評価に使用することができるが、我々の取り組みは、ブタによる感染感受性の欠如を示す以前の実験（Schlottauら、2020；Shiら、2020）を確認するものであった。
重要なことは、より多くの接種経路を試験したため、本研究はSARS-CoV-2とブタに関する他の研究を超えていることである。 しかし、いずれも子豚に生産的な感染をもたらすことはなかった。 本研究の重要な成果は、非経口的経路（IMおよびIV）で接種した豚において、14日目および22日目にスパイク糖タンパク質に対するセロコンバージョンが確認され、22日目に中和抗体の存在が確認されたことであった。 実験期間が22日と短いことを考慮すると、このような血清転換は、SARS-CoV-2の免疫原性研究にブタを使用することの可能性を強調している。 実際、免疫学だけでなく、生理学、薬理学、外科学など、人間の医学に応用できる適切な動物モデルとしての豚の興味は広く認められている（Rothkötter, 2009）。
結論として、本研究は、子豚がCOVID-19の適切な動物モデルではないことを確認したが、前臨床ワクチン開発研究における免疫原性のモデルとしてのその潜在的有用性は、さらなる調査を受けるに値する
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