Procedure
前向き参加者は、研究参加資格を決定するために構造化インタビュー手段により評価された。 学歴・病歴質問票（20）を用いて、人口統計学的情報、学業達成度、現在および過去の病状、薬物・物質使用に関する情報を入手した。 糖尿病、薬物乱用障害、精神・神経疾患の診断を受けている者は、ベンゾジアゼピン系薬剤のような結果指標に影響を与える可能性のある薬剤を使用している者と同様に除外された。 記憶障害の程度は、臨床的認知症評価（CDR）により判定した。CDRは、家庭や地域社会での日常的な活動で現れる認知機能低下の性質と程度について、参加者と情報提供者（通常は配偶者や成人した子供）から情報を引き出すものである（21）。 評価項目は、記憶、志向性、問題解決、地域活動、家庭活動、介護であり、各領域の評価は、記憶領域の比重が最も高いグローバルなCDR分類に寄与するものである。 CDR分類には、障害なし、軽度低下、軽度、中等度、重度の認知症が含まれる。 CDRの分類には、障害なし、軽度低下、軽度・中等度・重度認知症があり、軽度低下については軽度認知障害に相当し、CDR分類が障害なし、軽度・中等度・重度認知症の人は除外した。 グローバルCDR分類に加え、sum of boxes scoreも導出した。 このスコアは、6つの機能領域にわたるカテゴリー評価の算術和を表し、全体的な機能低下のレベルを定量化する手段となった（22）。
野生ブルーベリージュースは、Van Dyk’s Health Juice Products Ltd（カナダ、ノバスコシア州カレドニア）が熟した冷凍野生（ローブッシュ）ブルーベリーから商業的に準備し、北米野生ブルーベリー協会（米国、ミシガン州オールドタウン）がこの研究のために提供してくれたもの。 果実は解凍、圧搾、ろ過、低温殺菌され、1リットルの琥珀色のガラス瓶に瓶詰めされた。 1kgのブルーベリー果実から約735mLの一倍濃縮果汁が得られました。
この研究で使用した果汁のサンプルについて分析が行われました。 ワイルドブルーベリー果汁に最も多く含まれる溶存成分は、グルコース、フルクトース、リンゴ酸およびクエン酸であった(23)。 果汁中の総フェノールを比色測定したところ、2.38 g gallic acid equivalents/L という濃度が示された（24）。 果汁中の主要なフェノール類は、ヒドロキシ桂皮酸エステル、クロロゲン酸で約734 mg/L、フラボノイドのアントシアニンで877 mg cyanidin 3-glucoside equivalent/L juiceであり、他で述べたHPLC分析に基づく(25). ブルーベリー果汁中のアントシアニンおよびその他のフェノール類は、保存中に損失が生じることがある。 果汁サンプルの約3ヶ月の保存期間中、琥珀色の瓶で冷蔵保存された果汁の総フェノールとアントシアニンの損失は、それぞれ23％と20％と決定されました
体重によって決まる投与スケジュールを使って、1日の消費量は6 mL/kgから9 mL/kgに維持されていました。 体重54～64kgの人は444mL/日、65～76kgの人は532mL/日、77～91kgの人は621mL/日を処方されました。 表1は、本研究で使用したブルーベリージュースのサンプルから測定したフェノールとアントシアニンの摂取量に関するデータである。 この摂取量の範囲は、コンコードグレープジュースを用いたヒト試験で用いられた量に相当する（19,26）。 試験参加者は、どのサプリメントを摂取するかは知らされず、試験製品はグレープジュース、ブルーベリージュース、またはベリーのプラセボ飲料かもしれないことを告げられた。 ジュースは配布前に4℃の冷蔵室で保管された。 被験者はジュースを自宅で冷蔵保存し、1日の規定量を朝、昼、晩の食事と一緒に等分して摂取するよう指示された。 誤飲のリスクを最小限にするため、各被験者に個別の摂取量を記した容器を提供した。 介入期間は12週間であった。 これは、ヒトの全寿命に対する割合がネズミよりもはるかに小さいにもかかわらず、これまでのヒトと動物の研究の対応関係から、実質的に同じ期間内に生物学的反応が起こると予想された。 高齢の動物を用いた実験では、同様の期間ブルーベリーを補給することで、認知能力の向上が確認されている(12,14)。 さらに、ベリージュースを用いたこの期間のヒト試験では、炎症マーカーおよび抗酸化能力における有益な変化が示されています(26)。
Table 1
体重、総フェノール、アントシアニンによるブルーベリージュースの1日摂取量。
| 体重、kg | ブルーベリージュース摂取量、mL/d | フェノール、g gallic acid eq. | アントシアニン、g cyanidin 3-glucoside eq. |
|---|---|---|---|
| 54-64 | 444 | 1.056 | 0.428 |
| 65-76 | 532 | 1.266 | 0.512 |
| 77-91 | 621 | 1.478 | 0.598 |
被験者には、ベースラインの訪問時と介入6週目の中間訪問時にボトル入りジュースが配布された。 摂取プロトコルの遵守状況と副作用は，週1回の電話連絡と中間・最終訪問時の直接面接で評価した。 被験者には、試験期間中、ベリー類の果物やジュース、ベリー類の抽出物を避けるよう指示され、避けるべき食品とサプリメントのリストが提供された。 このリストには、ブルーベリー、ブラックベリー、チェリー、ブドウ、ブドウジュース、ザクロ、イチゴ、ワインなどの果物や飲料が含まれていた。
評価は治療前のベースラインと介入の最終週に行われた。 主要アウトカムは、Verbal Paired Associate Learning Test (V-PAL; 27) およびCalifornia Verbal Learning Test (CVLT; 28)を含む記憶機能の測定値であった。 V-PALは、若年女性、中年女性、高齢女性間の発達的なパフォーマンスの変化に敏感であることが示されている（30）。 この課題は、意味的に無関係な1音節または2音節の一般的な単語（例：help-years）の新しい関連付けを学習するよう被験者に要求するものである。 V-PALの成績は、4回の学習とテストの試行で合計された正答数の累積を表す。 CVLTは、広く用いられているリスト学習・想起課題で、加齢に伴う記憶変化、MCI、認知症に対する感受性があることが示されている(31)。 この課題では、一般的な単語を意味的なカテゴリーに分類した16項目のリストが使用される。 しかし、新たな関連付けを符号化する要求はない。 自由想起のスコアは、単語リストの保持を評価するために使用された。 これら2つの言語記憶検査は、やや異なる認知的要求を引き起こすため、この検査が実施された。 V-PALが新しい関連付けを必要とするのに対し、CVLTは個々の単語のリストの獲得と保持を必要とする。 両者とも海馬の処理に依存しているが、対の連想課題はより資源を必要とし、認知的加齢の影響をより受けやすい可能性がある(32)
それぞれの記憶課題の代替形式が、特定のテスト項目の内容を繰り返さないようにベースラインと最終診察時に用いられた。 代替フォームの使用は、特に記憶検査に関して、テストリテストデザインに関連する練習効果を大幅に軽減する(33)。 しかし、代替用紙は、手続き的練習効果、すなわち、試験手順への慣れに関する再試験時の成績向上を排除しないかもしれない(34)。
気分は、高齢者の抑うつ症状を評価するために設計された30項目の目録、老年抑うつ尺度（GDS；35）で評価した。 また、体重と腰回りを測定し、シンシナティ大学総合臨床研究センター（GCRC）の生化学研究所で血清グルコースとインスリン値を決定するために空腹時採血を行った。
主要な統計解析には、記憶パフォーマンス、気分、身体計測、代謝パラメータにおけるベースラインから最終訪問までの変化を決定する従属サンプルt-検定が含まれている。 統計的に有意な効果を報告するために、1型エラーのα確率を0.05に設定しました。 この試験の予備的性格を考慮し、α≤0.10で傾向を報告した。 また、これらの分析について、小（0.2）、中（0.5）、大（0.8）として特徴付けられるコーエンのd効果サイズ統計（36）を計算した。
反復記憶テストによる性能向上に関する懸念があるため、ブルーベリーサンプルの記憶性能を、付随研究のブドウプラセボサンプルと比較して、手続き的練習効果の可能性について制御する共分散分析（ANCOVA）も実行された。 これらの分析では、最終訪問の結果スコアを従属尺度として用い、ベースライン訪問の対応するスコアを共変量尺度として用いて、介入の効果を分離した(37)。 Cohenのf（36）は、これらの分析の効果量統計値を表し、小（0.1）、中（0.25）、大（0.40）である
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