レーザープリントを中心とした新しい微生物分離技術 | CDhistory

新しい分離方法

現在、これまで培養されていなかった新しい微生物を露出させるために、さまざまな方法が用いられている。 特に、特定の物質を含む新しい栄養培地を使用したり、大気組成、温度、pHなどの環境の物理的・化学的条件を変えて培養を行ったりすることが行われている。 さらに、希釈した培地と長期培養の組み合わせや、異種の微生物の共同培養などの応用も研究されている。 近年では、培地を用いずに自然環境中に微生物を配置する、根本的に新しい培養方法が開発されている。 このような方法では、微生物細胞が置かれた拡散チャンバーやポリマーコーティングを利用します。 この場合、微生物は自然環境から隔離されたまま、必要な栄養分をすべて自然環境から受け取ることができる。 このような方法を用いて、新しい抗生物質生産物質（テイキソバクチン）を割り当てたことは重要な成果であると考えられている。 また、多孔質ポリマーやセラミック製の分離チップ上で数万から数十万個の細菌コロニーを同時に培養し、スクリーニングする方法もある。 培養不可能な」微生物の培養には、自然環境から単細胞を分離する方法も用いられる。 その中でも、微生物懸濁液の希釈、フローサイトメトリーやセルソーティング、レーザーマイクロダイセクション、コンパートメント化、マイクロマニピュレーターの応用などが最もポピュラーな方法である。 これまで培養されていなかった種の微生物を培養することに加え、単一の微生物細胞を分離することは、細胞生理学、細胞間の相互作用の研究、さらには抗生物質や酵素などの新しい代謝物の探索に必要である。

現代の科学技術の進歩は、個々の細菌細胞やそのコンソーシアムの培養、分離、操作、研究のための新しい方法の開発の面で、多くの機会を提供している。 新しいアプローチは、微生物との共同作業を大幅にスピードアップし、より完全で包括的な研究を可能にするかもしれない。 しかし、マイクロメートルの精度でバクテリアアレイを位置決めする方法は、これまでほとんど提案されていないことに注意しなければならない。 Akselrodらは、多重ホログラフィック光トラップ（ピンセット）アレイを用いて、ハイドロゲル中の生きた細胞の3次元（3D）ネットワークを、その生存能力を失うことなく、これまでにない精度（<400 nm）で形成しました。 光トラップを形成するために、2つのレーザーを使用した。 Ar+レーザー（20 W、波長514 nm）と連続波チタンサファイアレーザー（λ = 850-900 nmの範囲で調整可能）、さらに2つの回折素子を組み合わせ、倒立光学顕微鏡の異なるレンズと組み合わせて使用しました。 バクテリアのリングに囲まれた3T3線維芽細胞のネットワークが形成された。 また、緑膿菌のバクテリアを2次元（2D）および3Dアレイで同時に数百個操作できることも実証された。 ホログラフィック光学トラッピングの方法は非常に正確であるが、技術的に難しい。

Rowanらの研究では、有機単層のマイクロコンタクトプリンティング、高分岐ポリマーの注入、そのさらなる機能化に基づく4段階のリソグラフィー工程である表面の不均一な機能化方法が提案されている。 その結果、細菌細胞を直接植え付けることができる構造体を得ることができた。 細胞の生存率を調査した結果、得られた構造体表面で細胞が生存し続けることが示された。 18±5個のバクテリアを含む大きな単離菌と2±1個のバクテリアを含む小さな単離菌が得られている。 この論文によれば，実証された方法は，ハイスループットなスクリーニングやバイオセンシングに用いることができる。 しかし，この方法による表面の不均一な機能化を，日常的な生物学的研究や微生物の培養条件（温度，pH，栄養など）と組み合わせることは困難である。 しかし、いくつかの論文において、生きたバクテリアのアレイの高解像度と様々な生物学的研究の機会を提供する簡単な方法を見つけるという課題が解決されたことに注目する必要がある。 2180>

Weibelらの研究では、アガロースプレートに生きた細菌をスタンプする技術が提案された。 最大50cm2の面積にバクテリアアレイを印刷した（バクテリアのある1つのスポットの大きさは>200μm）。 ポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプはフォトリソグラフィー技術によって製作された。 その結果、高さ140μmで190μmの突起が得られたが、バクテリアの分離に必要な大きさにはほど遠かった。 この方法は、高速で再現性があり、便利であるため、異なる細菌のコロニー間のパターン、間隔、および向きを制御するために使用することができます。 Xuらの研究では、高アスペクト比のエラストマー（PDMS）スタンプを用いて、細胞分解能の生きたバクテリアアレイをアガロース基板上に印刷し、逆in situリソグラフィー（RISL）法により得られた。 図1は、標準的な紫外線フォトリソグラフィーと比較したRISL法の利点を示している。 RISL技術の唯一の制限は、光回折限界のために、突起径が<1μmになりにくいことである。

バクテリアアレイのマイクロコンタクトプリンティングの方法は、次のように動作する。 大腸菌を培養液LB中に滴下し、アガロースゲル（LB中3重量％）に付着させ、アガロース基板上に、細菌の単層を形成する（液体はアガロースゲルに吸収される）。 その後、PDMSスタンプがアガロースゲルを覆っているバクテリアの単層と接触する。 スタンプを剥がすと、バクテリアの部分が残っている。 次に、アガロースゲル（LB中4wt%、厚さ200μm）の層にスタンプを接触させると、細菌はアガロース層に移行する。 このようにして、大腸菌のアレイをアガロース基板上に数ミクロンの分解能で、単一菌まで、大面積（cm2）に直接プリントすることができるのである。 パターンを印刷した後も、細菌は大量培養の条件と同様に増殖・分裂を続けること、すなわち印刷後も細菌が通常の生理的挙動を維持することが示された。 また、アガロースの濃度が印刷の性能を左右することも示された。 濃度が低すぎると印刷パターンに歪みが生じ、高すぎるとバクテリアの培養に適さない。 単一細菌のアレイを得るために、培養液LB1滴中の初期細菌濃度の低減効果を検討した。 初期濃度が109個/mlと108個/mlの場合、1スポットあたりの平均菌数を測定したところ、それぞれ12.1個と1.4個であった。 低濃度の菌数では、非常に狭い分布が得られた。 44.6%のスポットには大腸菌が1個だけ存在し、40.1%のスポットには0個または2個の大腸菌が存在することがわかった。 これらの結果から、マイクロコンタクトプリンティングにより、単一細菌の規則的なアレイを作製できることが実証された。 さらに、この方法でバクテリアアレイを分離することで、個々のバクテリアのラインの成長速度を分析できることが示されました。

急速に発展している社会微生物学では、物理的な接触や共通の微小環境の化学組成の変化を通じて、近傍の細菌に影響を与え、協調的・競争的関係に参加するメカニズムを明らかにしています。 小さな微生物集団の挙動を探るため、マイクロ流体デバイス、マイクロレゾネータ、超微量液滴などで細菌を制限するさまざまなマイクロプロセッシングの技術が開発されました。 分析システムとマイクロ流体工学を統合できることから、これらの分離プラットフォームは、抗生物質耐性や酵素活性分析のための高性能スクリーニングに魅力的なものとなっている。 例えば、Eunらには、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いたアガロース微粒子に内包された細菌細胞の高性能解析と単離が記載されている。 フローフォーカシングマイクロ流体システムを用いて、直径≈30 µmの単分散微粒子を作製した。 この粒子径はフローサイトメトリーやFACSに適合し、これらの方法の感度は分析実施前の細胞複製のためのインキュベーション時間を短縮することを可能にした。 また、微粒子の体積が小さいため（≒1～50ピコリットル）、細菌研究に必要な試薬の数を最小限に抑えることができた。 このプラットフォームにより、細菌を効率的に割り付け、分離することが可能になり、また、この方法を組み合わせることで、生物学的に活性な低分子の標的を迅速に同定することができるようになりました。 本手法の実験的実証として、大腸菌をアガロース微粒子に封入し、異なる濃度のリファンピシンの存在下で培養し、FACSを用いて解析した。 リファンピシンの最小阻害濃度を決定し、抗生物質耐性を持つ自然発生的な変異体をFACSを用いて単離し、DNA配列決定によりその特徴を明らかにした。 この方法を用いることで、変異体の単離に必要な時間と抗生物質の量は、栄養寒天培地を用いた従来の微生物学的手法と比較して、それぞれ8倍と150倍に削減された。 したがって、この方法はケミカルバイオロジー、天然物の化学分野、さらには生物活性を有する二次代謝産物の発見と特性評価において重要である。

上記のアプローチは、サイズ、形状、物理的属性（マイクロハビタット）を限定するためには有用であるが、細菌集合体の3次元形状や複数の集団の向きを任意に決定する機会を提供するものはなかった。 さらに、超微小容積のキャビティに細胞を封入するプロセスでは、しばしば物質輸送が制限され、物理的に孤立した集団間の成長やシグナル伝達とは相容れない条件となることがある。 細菌の繁殖におけるマイクロコロニーの重要性を強調する証明は増えつつあるが、そのようなコミュニティにおける細胞の挙動を系統的に評価するツールの欠如が観察される。 顕微鏡スケールで3D文化環境を作成するための新しい戦略は、細菌が小さな高密度の集合体で抗生物質耐性やその他の社会的行動をどのように管理するかを特定する上で重要な役割を果たすことができる。

Connellら、多光子リソグラフィー（MPL）に基づく顕微鏡3Dチャンバーのレーザー形成方法について述べている。 MPL法は高スループット能力を有し，任意のパターンを形成することが可能である。 この方法は，マイクロ光学部品，組織工学用足場，マイクロ流体チップなどの3Dマイクロデバイスの工業的生産の可能性を提供する。 Connellらの研究では、ウシ血清アルブミン（BSA）は、多孔質で耐久性があり、生体適合性のあるハイドロゲルに架橋できる高水溶性タンパク質で、顕微鏡レベルの3Dバクテリアチャンバーを作るために使用された。 このBSAチャンバー内に、体積1plの細菌を封入し、クローン集団を形成させた。 BSAの壁を通して生物学的に重要な分子や抗生物質が拡散し、定足数感受性信号が交換されるため、集団のサイズや密度、容器の形状、環境の流速に関連して、細菌集団の社会的挙動を調べた。

人体内では通常、細菌は複数の細菌種からなる構造化3次元集団で存在する。 病原性に対する形状の効果に関する詳細な情報を得るために、Connellらは、あるサイズ、形状、密度の物理的に異なるが化学的に相互作用する集団を、本質的に任意の形態で組織化できる細菌群集の3Dプリント戦略を記載している（図2）。 この方法を用いて、ある病原性細菌の1つの種が抗生物質に対して安定であることが、その3次元的な関係から2番目の種の耐性を高める可能性があることが示された。 レーザーリソグラフィ技術により、ゼラチン中に浮遊する選択された細菌の周りに、最大1plの容積、最大2μmの容器壁の微細な容器が、光増感剤分子によるレーザー光の非線形吸収によって焦点領域のポリペプチド分子が架橋されることにより形成された。 この多光子吸収の結果、一重項酸素が形成され、BSAとゼラチンの分子内および分子間の共有結合による架橋反応が促進されるのである。 ゼラチンのユニークな物理的・化学的特性は、細菌の保存、固定化、3次元培養など、さまざまな用途への活用を促すものである。 余分な試薬を除去した後、細菌は架橋ゼラチンによって形成された密閉された空洞に局在する。この空洞は非常に多孔性の材料であり、完全に封じ込められた細胞集団の迅速な成長をサポートする。 また、ポリペプチドや抗生物質が浸透しやすく、細菌間の相互作用に必要な物理的・化学的シグナルが伝わりやすい。 マイクロ容器に細胞を隔離することで、異なるタイプ/密度の容器を互いに埋め込んだり、コミュニティ内の細菌集団全体の向きをダイナミックに変化させたりする機会を提供します。

著者らは、グラム陽性黄色ブドウ球菌とグラム陰性緑膿菌（ムコビシドーシス患者の傷口、カテーテル、肺の中でしばしば持続性併発症を形成する2つのヒト病原体）の空間的局所相互作用により、βラクタム抗生物質を投与した場合のブドウ球菌生存率が高まることを明らかにしました。

マイクロ3D細胞印刷は、単一の細菌マイクログループが隣接する周囲または埋め込まれた集団の抗生物質感受性に影響を与えることができる場合、抗生物質耐性を調査する可能性を根本的に拡大するもので、特に生体内感染（たとえば 傷口、口腔、肺の嚢胞性線維症など）では、組織が同時に数種類の細菌によってコロニー化されることが多い。 3D細胞印刷の真の威力は、無限の幾何学的範囲にある微生物コミュニティを組織化する能力にあります。 また、マイクロ3Dセルプリンティングは、環境条件への適応反応のメカニズムやダイナミクスを調査するための貴重なツールとなり得る。