サイバネティクスと呼ばれる、人間の能力を拡張するバイオニックな器官や装置の設計と実装は、科学的関心が高まっている分野です1,2 。 特に、機能的な電子部品と生体組織や臓器を直接多次元的に統合する手法の開発は、再生医療、人工装具、ヒューマンマシンインターフェースに多大な影響を与える可能性があります3,4。 近年、組織表面に適合する柔軟性および伸縮性のある平面デバイスやセンサーを用いて、エレクトロニクスと組織の結合についていくつかの報告があり、心臓5、肺6、脳7、皮膚8、歯の表面における生化学的センシングや電気活動のプローブなどの応用が可能になりました9。しかし、生体組織や器官に3次元的に絡み合った電子部品を切れ目なく取り付けることは、かなり困難です4。
3D 印刷などの付加製造技術は、コンピュータ支援設計 (CAD) モデルを層にスライスし、生体細胞をインクとして使用して層を積み上げることにより、人間の臓器の正確な解剖学的形状を迅速に作成する能力によって、潜在的なソリューションを提供しています24。-3Dプリントのさまざまなバリエーションが、固体の自由形物製作の方法として使用されていますが、その使用は主に受動的な機械部品の製作に限定されています。24,28 押出しベースの3Dプリントは、カプセル化した細胞を含む膝半月板や脊椎間ディスクなどの硬組織スキャフォールドの製作に使用されてきました29。-さらに、ナノスケールの機能的ビルディングブロックを使用すると、調整可能な機能性を持つマクロスケールのコンポーネントをボトムアップで自在に組み立てることができます。 これにより、ナノエレクトロニクス材料と生体細胞を同時にプリントして、ユニークな機能を持つ3次元統合サイボーグ組織や器官を作り出すことができる。 電子回路は感覚器や情報処理装置の中核であるため35、印刷したハイブリッド構造を体外で培養することで、人間の生物学的特性を上回る機能を持つ「サイボーグ臓器」を育成することができる。 私たちのアプローチでは、最終的な立体造形形状が完成するまで、さまざまな材料をレイヤーごとに押し出し、空間的に不均一な構造体を定義・作成することができます。 生きた細胞を電子部品とともに3Dプリントし、機能的な器官に成長させるというこのコンセプトは、エレクトロニクスと生体システムを融合させるという新しい方向性を示しています。 実際、このようなサイボーグ臓器は、人工組織や共形平面/柔軟エレクトロニクスとは異なり、エレクトロニクスと組織の3次元的な融合を達成するユニークな方法です。
このアプローチの概念実証として、人間の聴覚に代わる機能を可能にする電子部品を含む耳介を、3Dプリントで実現する能力を評価しました。 耳介のような主に軟骨組織からなる人間の臓器は、私たちのアプローチの実現可能性を調査するのに適したプロトタイプの候補となります。 これは、1）耳の解剖学的形状が複雑で、従来の組織工学的アプローチによる生体工学が困難であること、2）血管がないため軟骨組織レベルの構造が単純であることによる。23,36 さらに、ナノエレクトロニクスマトリックスのボトムアップ組み立てにより、機能性マクロスケール電子部品を階層的に生成することができる。 具体的には、軟骨細胞を播種したアルギン酸ヒドロゲルマトリックスに導電性銀ナノ粒子（AgNP）を注入した誘導コイルアンテナを3Dプリントし、シリコーンに支持した蝸牛型電極に接続することを実証している。 7833>
Additive Manufacturingによる生物学とエレクトロニクスを3次元的に織り込んだバイオニックイヤーを生成すること。 (A)バイオニックイヤーのCAD図面。 (B）（上）バイオニックイヤーを形成するために使用される生物学的（軟骨細胞）、構造的（シリコーン）、電子的（AgNP注入シリコーン）などの機能材料の光学画像。 (下）印刷工程に使用した3Dプリンター。 (C）3Dプリントされたバイオニックイヤーのイラスト
このプロセスには、次のような段階がある。 まず、バイオニック・イヤーのCAD図面（図1A）を使用して、解剖学的形状および様々な機能材料の空間的不均質性を規定する。 前述したように、バイオニックイヤーの3つの機能構成要素（構造、生体、電子）を3つの材料で構成している。 これらの材料は、シリンジ押出ベースのFab@Home 3Dプリンタ（The NextFab Store, Albuquerque, NM）に投入されます（図1B）。 次に、印刷したバイオエレクトロニクスハイブリッド耳構造体を体外で培養して軟骨組織を成長させ、受信アンテナとして機能する誘導コイルによって無線周波数（RF）範囲の電磁信号を感知する能力を持つサイボーグ耳を形成します（図 1C）。 足場には、アルギン酸ハイドロゲルマトリックスに生存軟骨細胞を6000万個/mLの密度であらかじめ播種しておいた（参考情報参照）。 印刷に用いた軟骨細胞は、1ヶ月齢の子牛の関節軟骨から単離したものである（Astarte Biologics社、Redmond、WA）。 蝸牛型電極に接続された円形コイルアンテナを内蔵したヒト耳介のCAD図面（STL）を用いて、モデルを輪郭とラスター充填パスの層にスライスし、印刷パスを定義した。 生きている軟骨細胞をあらかじめ播種したアルギン酸ハイドロゲルのマトリックスで架橋を開始し、導電性（AgNP注入）および非導電性のシリコーン溶液とともに3Dプリントしました（動画1）。 7833>
図2Aは、3Dプリントしたバイオニック・イヤーを印刷直後に示したもので、このように、バイオニック器官の生体、電子、構造コンポーネントを1つのプロセスで作製しました。 注目すべきは、CAD図面を忠実に再現し、設計通りに各材料の空間性を正確に再現していることである。 印刷された耳の構造体は、10%または20%のウシ胎児血清（FBS）を含む軟骨細胞培養液に浸され、1-2日ごとにリフレッシュされた（参考情報参照）。 ハイブリッド耳は、培養下で良好な構造的完全性と形状保持を示した（Fig. 2B）。 これは培養の4週間後に最も顕著であり、細胞外マトリックス（ECM）の形成と肉眼的に一致している。 7833>
バイオニック・イヤーの成長と生存能力。 (A)3Dプリントされたバイオニックイヤーの印刷直後の画像。 (B)体外培養中の3Dプリントバイオニックイヤーの画像。 (A)および(B)のスケールバーは1cm。 (C) 印刷プロセスの様々な段階での軟骨細胞の生存率。 エラーバーはN=3での標準偏差を示す。 (D) 軟骨細胞を播種したアルギン酸（赤）またはアルギン酸のみ（青）からなる培養中の印刷耳の重量の経時変化。 エラーバーは標準偏差を示し、N=3である。 (E）H&E染色による軟骨細胞形態の組織学的評価。 (F)10週間培養後の新軟骨組織のサフラニンO染色。 (G)コイルアンテナに接触した新軟骨組織の生存率を示す写真（上）と蛍光画像（下）。 (H) 電極に接触した内部軟骨組織の生存率を示すバイオニックイヤーの断面の写真（上）および蛍光写真（下）。 上部のスケールバーは5mm、下部は50μm。
生存率は、印刷プロセスの様々な段階の直前および間に試験された。 細胞の初期生存率は、トリパンブルー細胞排除アッセイ（Corning Cellgrow, Mediatech, VA）を用いて培養後に決定し、96.4±1.7％であることが分かった（図2C）（Supporting Informationを参照）。 印刷された細胞入りアルギン酸耳は、LIVE/ DEAD® Viability Assay (Molecular Probes, Eugene, OR) でも試験され、91.3 ± 3.9% の細胞生存率と均質な軟骨細胞分布が確認され ました。 この結果は、細胞のカプセル化と堆積を含む印刷プロセスが、軟骨細胞の生存率に大きな影響を与えないことを示唆しています。
注目すべきは、プレシードされたハイドロゲル基質を印刷するこのアプローチにより、従来のプレモールド3D足場へのシード方法におけるシード深さの制限と不均一なシードに伴う大きな問題が解消されている点です。 生体吸収性アルギン酸マトリックスに軟骨細胞を播種し、3Dプリントで成形すると、細胞が所望の形状に局在し、栄養培地で培養したときに定義された場所で新しいECMを生成することができる。 組織が発達すると、ポリマーの足場は再吸収されるため（図2D）、新しい組織は、細胞が播種されたポリマーの形状を維持したままとなる。 生分解性の足場により、各細胞は栄養へのアクセスが良くなり、より効率的に老廃物を除去することができる。
次に、組織学的評価により、バイオニック耳の新軟骨における軟骨細胞の形態を、本来の軟骨組織のものと比較した。 ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色により、構築物の軟骨細胞の均一な分布が明らかになった（図2E）（Supporting Information参照）。 サフラニンO染色による耳組織の組織学的検査では、培養された耳組織にプロテオグリカンが比較的均一に蓄積していることが示された（Fig.2F）。 最後に、フルオレセインジアセテート（FDA）とヨウ化プロピジウム（PI）染色を用いて、10週間の体外成長培養後の3Dプリントバイオニック耳組織の生存率を蛍光測定で確認した。 図2Gと2Hは、それぞれコイルアンテナを覆う組織と、組織を垂直に走る電極と接触している内部組織を示しています。 いずれの場合も、成長した軟骨は優れた形態と組織レベルの生存率を示していた。 注目すべきは、アビオティックな電子材料の存在下で組織を培養するこのアプローチにより、成長した組織の免疫反応を最小限に抑えることができたことです。
次に、ECMの発達は成長する組織の力学的性質と強く相関していることから、成長のさまざまな段階における軟骨の力学的特性を評価しました39。まず、広範囲にわたる生化学および組織学の特性評価が行われました。 新軟骨のDNA含量の測定とECMの生化学的評価のため に、2、4、6、8、10週目に10%と20%のFBSを含む培養物 からサンプルを取り出し、冷凍保存した（参考情報参照）。 構築物におけるECM蓄積は、ECMの2つの重要な成分、1）コラーゲン含量のマーカーとしてのヒドロキシプロリン（HYP）、および2）プロテオグリカンのマーカーとしての硫酸化グリコサミノグリカン（GAG）の量を定量することによって評価された。 10週目までに、HYP含量は、10%と20%のFBSを含む培養物でそれぞれ1.2 ± 0.1 μg/mg、1.4 ± 0.2 μg/mgまで増加した（図3A）。 10週目のGAG含量の対応する値は、10.6 ± 0.6 μg/mgおよび12.2 ± 1.0 μg/mgであった（図3B）。 このGAGおよびHYP含量の増加は、軟骨細胞が培養中に生きており、代謝的に活発であることを示している。
3Dプリントした新軟骨組織のバイオメカニカルキャラクタリゼーション。 (A)20%(赤)と10%(青)のFBSを用いた培養におけるHYP含有量の経時変化。 (B）20％（赤）と10％（青）のFBSで培養した場合のGAG含量の経時変化。 (C) 2,000万個（青）および6,000万個（赤）の細胞/mLで培養した3Dプリント犬骨構築物のヤング係数の経時変化。 A-Cのエラーバーは、N=3での標準偏差を示す。 (D) 耳介の様々な解剖学的部位と、それに対応する硬度を表1に示す。 スケールバーは1cmである。
次に、引張特性を、3Dプリント軟骨-アルジネート犬骨サンプルを、犬と同じ細胞密度および耳と同一の培養条件を含む培養の種々の時点で試験して分析した（援用情報を参照されたい）。 機械的特性を評価した結果、ドッグボーンのヤング率は、14.16kPaから10週目の111.46kPaまで経時的に増加した（図3C）。 成長組織の力学的特性における初期軟骨細胞密度の影響を理解するために、軟骨細胞密度が2000万個/mLと低いドッグボーンも同様の条件で試験した。 その結果、10週目には73.26kPaという低いヤング率を有していることがわかった。 次に、3Dプリントした耳介の成長した軟骨組織の硬度をナノインデンテーション測定により評価しました。 圧痕は耳介の様々な解剖学的部位で行った（図3D）。 表1に示すように、これらの硬度値は38.50 kPaから46.80 kPaの範囲で比較的均一であることが判明し、プリントした耳の構造的完全性が確認されました40。
表1
| 部位 | 平均硬度（kPa） | |
|---|---|---|
| 1. Helix | 44.85 ± 2.68 | |
| 2.凸部 | 3. Scapha | 38.93 ± 3.00 |
| 3. Fossa | 42.40 ± 2.87 | |
| 4. Crura Antihelix | 45.47 ± 3.95 | |
| 41.53 ± 4.36 | ||
| 6. Crus of Helix | ||
| 7. アンチヘリックス | 40.67 ± 3.13 | |
| 8. 螺旋頭 | ||
| 9. トラガス | 40.10 ± 2.42 | |
| 10. Antitragus | 39.27 ± 3.26 |
3D プリントバイオニックイヤーの機能強化の実証のため、一連の電気特性測定を実施した。 まず、コイルアンテナの抵抗率を4点プローブ測定で測定し、導電性AgNP注入シリコーンを印刷するために使用した体積流量に依存することが分かった（参考情報参照）。 最適な流量では、印刷されたコイルの抵抗率は1.31 × 10-6 Ω-mであり、純銀（1.59 × 10-8 Ω-m）よりも2桁だけ高いことがわかった。 次に、無線電波の受信実験を行った。 通常の可聴信号周波数（ヒトでは20Hz～20kHz）を超える信号を受信できることを実証するため、バイオニックイヤーの誘導コイルからのびる蝸牛型の電極に外部接続を形成した（図4A）。 その後、1MHzから5GHzの周波数の正弦波を耳に照射した。 ネットワークアナライザーを用いてコイルアンテナのS21（順方向透過係数）を解析したところ、この拡張した周波数帯域で信号を伝送することがわかった（図4B）。 (A）バイオニックイヤーの特性評価に使用した実験セットアップの画像。 耳には送信用ループアンテナからの信号が照射される。 出力信号は蝸牛の2つの電極に接続され、収集される。 スケールバーは1cm。 (B)バイオニックイヤーの高周波に対する応答。 (C) (上)2つの相補的なバイオニックイヤーの無線信号受信の模式図（左と右）。 (下）立体音響音楽を聴く相補的なバイオニック・イヤーの写真。 (D)右耳と左耳のオーディオ信号の送信（上）と受信（下）。
最も重要なことは、CAD設計を修正することによって最終的な器官に変更を加えることの汎用性の実証例として、元のモデルを単に反映させて補う左耳を印刷しました（サポート情報参照）。 立体音響の左右のチャンネルは、フェライトコアを持つ送信磁気ループアンテナを介して、左右のバイオニックイヤーに照射されました（図4C）。 バイオニックイヤーが受信した信号は、二重蝸牛型電極の信号出力から収集され、デジタルオシロスコープに供給され、聴覚および視覚モニタリングのためにラウドスピーカーで再生された。 図4Dに、左右のバイオニックイヤーの持続時間1msの送受信信号の抜粋を示したが、音声信号の優れた再現性を示していることが分かる。 また、受信した信号から再生された音楽（ベートーベンの「エリーゼの詩」）も良好な音質で再生されています（動画2）。 私たちの戦略は、積層造形技術の汎用性とナノ粒子集合体および組織工学の概念を融合させた原理実証を意味します。 その結果、組織工学のベンチマークと電気的測定によって検証されたように、形態と機能の両方において、正真正銘のバイオニック臓器を生成することができる。 このようなハイブリッドは、人工組織や平面・柔軟エレクトロニクスとは異なり、エレクトロニクスと組織をシームレスに統合し、「既製」のサイボーグ臓器を生成するユニークな方法である。 最後に、半導体、磁性体、プラズモン、強誘電体ナノ粒子など、他のクラスのナノスケール機能性ビルディングブロックと3Dプリントを使用すれば、バイオニック組織や臓器を工学的に作る機会が拡大する可能性がある
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