眼内注射に対する眼反応
ACAID誘導の中心となるF4/80+単球系細胞は虹彩や毛様体の常在細胞で、虹彩からシュレム管1、6、10を通って循環に移行していると考えられてきた。 抗原は少なくとも 24 時間眼球内に存在するため、抗原の腔内注射後、抗原の一部は急速に循環に移行するものの、抗原は「デポ」効果を有する可能性があります8。 抗原を眼内に注射すると、ACAID を誘発する PBMC が出現するため、循環している抗原だけでなく、これらの単球系細胞が ACAID を誘発する可能性があります。 さらに、眼感染症は後房や前房に強い炎症浸潤を引き起こす。12-14 このような炎症と一致して、房水などの眼液中の炎症性サイトカインが上昇する。 また、TNF-αに対する抗体を抗原とともに腔内投与したマウスでは、遅延型過敏症の全身的な抑制が起こらないことから、ACAIDの誘導にはTNF-αが必要であることが示唆されています。 さらに、これらの研究では、ACAID の誘発は、可溶性タンパク質の腔内注入に使用した針の太さや、抗原が粒子状であるか可溶性であるかに依存していた15。これらの著者らは、粒子状の抗原の腔内注入や腔内注入に使用した針の太さが、ACAID の誘発に必要な外傷を引き起こすと示唆している。 前眼部の虹彩、毛様体、脈絡膜には、樹状細胞マーカーCD11cを発現するマクロファージや樹状細胞が常在し、前眼部に注入された抗原はこれらの細胞によって速やかに取り込まれる。 また、マクロファージや樹状細胞がシュレム管付近に存在し17,18 、F4/80+細胞が前房から循環器へ排出される場所と考えられている。 眼球から排出される抗原の一部は、寛容性のある形態である可能性がある19 。しかし、眼球内の抗原は、抗原とともに眼球を排出したいわゆる「寛容性抗原提示細胞」によって胸腺および脾臓で提示される可能性が高い。 さらに、房水中のTGF-βや虹彩F4/80+細胞の産生するTGF-βは、末梢F4/80+細胞に抑制的表現型を誘導する10,20,21ことから、F4/80+細胞の抑制的表現型の誘導は前房で起こることが示唆される。
末梢性F4/80+細胞を房水と抗原で処理した場合と同様に、F4/80+腹腔滲出液を抗原およびTGF-βとin vitroでインキュベートすると、細胞に抑制性の表現型が付与される。 この細胞をナイーブマウスに静脈注射すると、抗原の腔内注射で得られたのと同様の抗原特異的脾臓制御性T細胞が誘導される。21 ACAIDは、この方法で処理した非常に少数のF4/80+細胞によって誘導されることから1、虹彩および毛様体から遊走する（検出できない）細胞が、ACAIDを誘導する可能性が示唆された。 さらに、抗原を虹彩内に注射したマウスから回収した F4/80+ 虹彩細胞は、ACAID の誘発、あるいは F4/80+ PBMC に、抗原を虹彩内に注射したマウスから回収した循環細胞と同様の抑制表現型を与える9,21。 虹彩抗原提示細胞によって取り込まれ処理された抗原は、TGF-β処理された抗原を持つ腹膜滲出液細胞によって脾臓のACAID誘導B細胞に抗原が移動するのと同様に、前室に浸潤したPBMCに移動する可能性があると考えられます22。 4575>
以上の考察に基づき、我々は抗原の腔内注入が、注入時の外傷により循環PBMCの前房への流入を誘導する可能性を検討した。 これらの浸潤細胞は、房水中の免疫抑制性TGF-βや虹彩・毛様体常在樹状細胞にさらされ、注入された抗原を浸潤したPBMCに提示する可能性があると考えられる。 この仮説によると、注射による傷害のために前房に動員された細胞は、その後胸腺や脾臓に再循環し、制御性 T 細胞を誘導する。
オバルブミン (OVA) の腔内注射後 3 時間以内に、Ferguson et al.15 が述べたように、房水の TNF-α 上昇も確認された。 さらに、ケモカインであるMCP-1も、腔内注射の6時間後に房水中で上昇することが確認された（Fig.1）。 PBSを注入しない針刺しでは、房水中にTNF-αが出現し、PBS注入では、針刺しで得られたTNF-αの量の5倍しか増加しないことがわかった。 房水中のTNF-αは急速に減少し、オバルブミン（OVA）の腔内注射の12時間後には検出されなくなる（データなし）。 MCP-1は、より長い期間、房水中に維持される。 しかし、TNF-αとは異なり、MCP-1のレベルは12時間までに房水中でピークに達し、OVAのカメラ内注入後16時間まで維持される（データは示されていない）。 このように、抗原の腔内注射後の房水中のTNF-αおよびMCP-1レベルの上昇は、前房内での炎症反応の開始を示唆するものである。 さらに、腔内注入に使用した針が小さすぎる場合や抗原に炎症性がない場合は、房水中のTNF-αは上昇せず、ACAIDも誘発されない15
腔内抗原注入により房水中のTNF-aとMCP-1を上昇させることがわかった。 6-8週齢のナイーブ雌BALB/cマウスに5×106-1×107 CFSE標識PBMCを静脈注射してから3-6時間後に、ケタミン/キシラジン7をip注射して麻酔し、PBS、PBS＋50μg OVA、24g針のみのameral内注射を受けた。 ナイーブマウスが腔内注射を受けた6時間後、安楽死させたマウスから房水を回収し、10μlをTNF-αおよびMCP-1についてELISAでアッセイした。 データは2-3回の実験で4-6複製/群から検出された平均+/- S.E.M. pgを表す。
抗原の腔内注射後に前房への炎症細胞の流入が付随しているかどうかを調べるために、蛍光色素CFSEでラベルしたPBMCを静脈注射したマウスにも腔内注射をした。 この方法では、ケモカイン受容体CCR2およびCCR5を発現するCFSE標識および非標識（宿主）のF4/80+単球系細胞の著しい流入が観察され、マウスの虹彩からこれらの細胞の回復が抗原の腔内注射の24時間後に示される。 抗原の腔内投与から約 48 時間後、虹彩に浸潤した細胞数は減少し、胸腺および脾臓で増加した（図 2）。 この虹彩での循環単球の増加は、マウスが虹彩内に抗原を受けたときに浸潤単球細胞数が増加したことから、虹彩内注射の外傷＋／-PBSおよび／または抗原／PBSの刺激に応答した循環単球の浸潤によるものと考えられる：注射のみによって誘導したCFSE-標識PBMCの浸潤は＜6327＞PBS注射 ＜6327＞TNP-BSA/PBS の注射である。 23 CCR2 -/- PBMCは虹彩に到達しないが、CCR5 -/- PBMCは抗原を虹彩に到達することから、虹彩への細胞の移動にはCCR2ではなくCCR5の発現が必要であることがわかった。 さらに、CCR2 -/-マウスへのOVAの腔内注射は、野生型レシピエントにiv注射したときにOVAに対する遅延型過敏症（DTH）の抑制を移す循環単球系細胞を誘導しない23
腔内注射後のPBMCの遊走。 麻酔をかけた7 BALB/c マウスにトリニトロフェニル化ウシアルブミンを、5 × 106 -1 × 107 CFSE標識PBMCを静脈注射してから6時間後に腔内注射をした。 腔内注射の24時間後にマウスをCO2吸入により安楽死させ、虹彩、脾臓および胸腺を摘出し、プールして単一細胞懸濁液を調製した。 その後、細胞をフィコシアニン-抗F4/80で標識し、フローサイトメトリーで分析した。 CFSE、F480+細胞の増加率は、以下の式で計算した：