Structural Implications
システイン含有変異タンパク質（K41C）をブロモエチルアミンで修飾した結果、野生型RNase Aと非常に近い酵素が得られた。しかし、K41S-ethylaminocysteine RNase Aが触媒するkat/Kmの値は野生型酵素のわずか8％に過ぎなかった。 この2つのタンパク質の違いは、チオエーテル基とメチレン基の違いにあるのだろう。 分子モデリングによると、S-エチルアミノシステインとリジンの一級アミン基は0.1Å以内で重ね合わせることができる。S-エチルアミノシステインとリジンのより大きな違いは、アンチトーション角よりもゴーシェ角を好むことである15。 実際、遷移状態アナログとされる環状2′3′-ウリジン バナジウム（U>v）とRNase Aの複合体では、平均K41ねじれ角は（175 ± 3）°である（図2）。 分子モデリングにより、41位のS-エチルアミノシステイン残基のCS-CC結合は、ネイティブタンパク質の構造を乱すことなく、ガウチョ型コンフォメーションになり得ることが示された17。 したがって、41位のチオエーテル側鎖は、アルキル側鎖よりも剛性が低く、伸長している可能性が高い。 S-エチルアミノシステイン酵素による触媒作用は、チオエーテルをオールアンチコンフォメーションに固定するためのエントロピーコストにより、野生型RNase Aによる触媒作用ほど効率的ではないと我々は推測している。
ウリジン2′，3′-シクロバナデートに結合したRNase Aの活性部位構造。 pH5.3で育成した結晶から得られたX線と中性子の回折データから2.0Åの精度で構造を決定した。 フェニルアラニン120の側鎖とウラシル塩基は示していない。
触媒効率は、残基41の側鎖の長さに依存する。 リジンよりも長い側鎖の末端にアミノ基を提示するRNase A変種は、未修飾のK41C RNase Aよりも活性の高い触媒である。 さらに、41位のアミノ基が主鎖から4原子分離れた酵素は、5原子分離れた酵素よりも活性が高い。 この結果は、より長い側鎖の付加的なコンフォメーション・エントロピーまたは不利なねじれ角から生じる可能性がある
残基41が第2の水素結合を提供できる場合には、大きな利点は得られない。 グアニジノ基およびアセトアミジノ基は、ホスホリル基の2つ以上の酸素と同時に相互作用する可能性を有する。 例えば，グアニジノ基はHIV-1 Tatタンパク質18や人工受容体によってリン酸基との結合に用いられている19。さらに，Staphylococcal nucleaseやT1ファミリーのリボヌクレアーゼでは，アルギニンがRNase AのK41の役割を担っているようである20。 これらの酵素のΔΔG‡の値は、41位の側鎖に一級アミノ基のみを持つ類似の酵素の値より小さい。 したがって、効率的な触媒作用をもたらすには、1つの水素結合で十分であると思われる。 この結果は、RNase AとU>vの結晶複合体（図2）とも一致する。 U>vのバナジル基は、2つの橋渡しでない赤道上の酸素、O1VとO3Vを持つほぼ三角錐の双子座である。 酸素O1Vはグルタミン11の側鎖から水素結合を受け入れ、一方、O3Vはフェニルアラニン120の主鎖から水素結合を受け入れている。 O1VだけがK41から水素結合を受け入れる位置にある。
Mechanism Implications. K41に最もよく起因する触媒的役割は、RNA切断時に非架橋リン酸オキシゲンに蓄積された過剰な負電荷を安定化させることである（図2）。 電荷の蓄積は、5配位の遷移状態（またはホスホラン中間体）において、2位の水酸基がリン酸を攻撃し、5位のヌクレオシドを置換する際に起こる可能性がある。 この安定化はクーロン相互作用によって起こると考えられてきた12c,21が、最近ではK41からのプロトンの部分的な移動を伴う短くて強い水素結合によって起こるとも提唱されている22
リジン残基の顕著な特徴は、その正電荷と水素結合を提供する能力である。 5種類の半合成酵素のうち3種類とK41Rはこれらの特徴を有している。 クーロン力のみに基づく相互作用と、2つの荷電種間の水素結合に基づく相互作用を区別することは、簡単な問題ではない。 以下は、表1のデータと一致する最も単純な説明である。
水素結合とクーロン力の区別は、末端正電荷を持つが水素結合を供与する能力を持たないS-エチルトリメチルアミノシステイン酵素と、水素結合供与が可能なアミドN-Hを持つが正電荷を持たないS-アセタミドシステイン酵素を比較すれば最も明白である。 S-エチルトリメチルアミノシステイン酵素の低い触媒活性は、遷移状態の安定化におけるクーロン力の有効性を強く否定するものである。 他の条件が同じであれば、電荷-電荷相互作用のエネルギーは距離の逆数としてのみ減少する。 S-エチルアミノシステイン酵素に比べ、側鎖の正電荷とホスホリルオキシゲンの間の距離は、メチル基によって長くなっている。 しかし、この距離は、観察された>103倍のkcat/Kmの減少を引き起こすほど大きくはないと考えられる。 表1に示すように、同等の長さの側鎖を持つ半合成酵素では、pKaの増加は、実際にΔΔGの減少に対応している。 しかし、側鎖の長さがリジンと同程度の半合成酵素の場合、相関は非線形である。 この直線性の欠如は、各側鎖のpKaがネイティブタンパク質中の特定の環境に依存するために生じる可能性がある。 実際、Lys41のpKaは、表1のブチルアンモニウムイオンについて記載されている10.6ではなく、9.0であることが決定されている24。 異なる側鎖は異なる影響を受けるかもしれない。 もう一つの、おそらくより重要な非線形の原因は、荷電種が非荷電種よりも強い水素結合に参加する傾向があることである。 この現象はタンパク質25 やアミンなどの低分子化合物で観察されている26 。アイソステリックだが形式電荷が異なる側鎖を持つ半合成酵素を比較すると、そのような傾向が明らかになるはずである。 例えば、S-アセトアミジノシステインとS-アセトアミドシステイン酵素では、41位の側鎖は末端炭素に付いた2つのヘテロ原子のうちの1つを除いて同じものである。 しかし、これら2つの同型の側鎖の遷移状態への結合能力の差は、その酸度のみから予想されるよりも大きい。 ここでは、帯電したアセトアミジンから供与される水素結合は、帯電していないアミドから供与されるものより4 kcal/mol強いことがわかった。 この値は、タンパク質-リガンド相互作用における荷電および非荷電水素結合の相対強度に関する他のデータと一致している21。最後に、S-アセトアミド側鎖は形式電荷を持たず、比較的高いpKaを持っているが、それでも触媒作用に（わずかではあるが）貢献していることは注目される。 この結果は、残基41によって供与される水素結合が触媒作用に重要であることをさらに証明するものである
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