Cell survival after irradiation
Istigation of radiation induced cell growth and death.The Radiiation in a rapid reaction of acid resistance of the bloyric acid in the blobyric acid in a rapid reaction by a blobyric acid by the metabolic switching, 細胞に対する放射線の影響を調べる方法として、増殖能の完全な喪失または増殖能の高揚に要する期間と定義される、最も一般的で信頼性の高い方法の1つです。 照射実験では、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）の測定値が、少なくとも指数関数的に成長する段階のin vitroの細胞数に比例することを当研究室で確認した（データ未掲示）。 高エネルギーでの12C6+イオン照射は、通常、大部分の細胞を死滅させる。 照射後のラグフェーズにおける細胞死の割合や、倍加時間の変化は、照射後の様々な時点でアッセイすることで測定できる。 私たちのアッセイは生存率の1点判定だけでないため、増殖性能に関する情報も容易に取得することができた。 6552>
C. tyrobutyricum 25755細胞は播種後20時間で照射され、生存率は自然対数スケールで異なる物理パラメータに対して描かれた生存曲線であった。 照射後にプレーティングを行う際に、代謝活性が最も低く増殖が遅い株や増殖が停止した細胞は、洗浄とトリプシン処理によりアッセイから除外した。 式(1)から得られる生存率を代表的な実験データ群と比較した。 図1は、C. tyrobutyricum ATCC 25755の様々な株について、異なるビームエネルギーで12C6+イオン照射した後の生存曲線の比較を示している。 MTTアッセイの結果は、エネルギー68 AMeV、106から108個-パルス-1レベルの照射線量（10から50 Gy）に対してプロットされており、図1Aではe0 →e-4.5、図1Bではe0 →e-5.8、図1Cではe0 →0となっています。 図1D-Fは、エネルギー114AMeV、イオンパルス-1レベル106〜108の照射線量（10〜50Gy）に対するMTTアッセイの結果をe0 →0とした細胞生存率データで、全般的に計算と実験データの間に十分な一致が得られていることが分かります。 68AMeVで照射した株では、式は線量の効果を過小評価したが、高エネルギー(114AMeV)で照射した細胞では、結果は過大評価された。 ある効果レベルに対する計算値と実測値の比から導き出される最大偏差は15%であった。 また、ひずみの生存率は、12C6+-イオンビームの物理特性（エネルギー、線量、イオン-パルス-1レベル）に強く依存することがわかった（図1）。 明らかに、生存率は炭素イオンのエネルギーの増加とともに減少した。 予想通り、アッセイの生存対数は同じ特性を示した：生存率は12C6+イオン照射のエネルギー、イオン-パルス-1、線量に依存する。 物理パラメータを1つずつ増加させると、生存率は低下した。 12C6+-ionを114AMeVのエネルギー、20から40Gyの線量、106から108ions-pulse-1で照射した場合、非常に限られた生存率 (e-3.5 → e-6.5) となった。
Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755の生存に対する12C6+イオン照射の影響についてです。 播種後20時間後に照射し、生存の程度をMTTアッセイで測定した。 生存率データは、照射レベルに対してプロットされている。 (A-C) 12C6+-イオンは68AMeVまで加速され、そのイオン/パルスは106から108、線量率は10から50Gyであった。 (D-F) 12C6+イオンは114 AMeVまで加速され、そのイオン/パルスは106から108、線量率は10-50 Gyであった。 代謝活性が低く増殖の遅い細胞や増殖を停止した細胞は、照射後にプレーティングを行う際に洗浄とトリプシン処理によってアッセイから除外した。
多くの細胞種は12～24時間ごとの規則的な細胞分裂によって特徴づけられる。指数増殖力のために、一つの細胞は約9から12の正常分裂サイクル、つまり数日間に数千の娘細胞を生み出すことが可能である。 照射後の生存者は、その後、いくつかの突然変異体で構成されることがある。 6552>
The effects of butyric acid on cell growth after irradiation
C. tyrobutyricum ATCC 25755はグルコースまたはキシロースを炭素源およびエネルギー源として利用する。 この単糖はphosphoenolpyruvate dependent phosphotransferase uptake systemを経由して細胞内に輸送される。 その後、グルコースまたはキシロースは解糖系で代謝されるが、pH7からpH5.5の範囲ではpH依存性はほとんどない。 しかし、グルコースまたはキシロースが細胞内で消費されなくなると、酪酸による阻害のため発酵が停止した。 細胞増殖プロファイル（600nmにおける細胞懸濁液の光学密度（OD）の測定に基づく）に対する照射の特異的効果をさらに調べるため、個々のバッチ培養を、42g-L-1のグルコースを含み、3.6、7.2、10.8g-L-1の酪酸を補充した化学的に定義したP2培地で（血清瓶で実施）実施した。 C. tyrobutyricum ATCC 25755（図2A、コントロール）の培養物のpHは、3.6 g-L-1の酪酸を補充した場合（図2A1）と比較して約4.8（ΔpHは、pH 6.2 から 1.4 ）に低下し、7.2 g-L-1 の酪酸（図 2A2）および 10.8 g-L-1 の酪酸（図 2A3）を添加した場合、対応する pH 値はそれぞれ約 6.0（6.5 から開始するΔpH 0.5），6.1（6.4 から開始するΔpH 0.3），5.9（6.4 から開始するΔpH 0.5）であることがわかった。 しかし、この培養物に68 AMeVを40 Gyの線量で照射すると（図2D、コントロール）、pHは4.8程度まで低下した（6.5から始まるΔpHは1.7）一方、40 Gyの線量では（酪酸3.6 g-L-1 を添加）（図2D1）、7.2 g-L-1 の酪酸を添加）（図 2D2）、40 Gy の線量（10.8 g-L-1 の酪酸を添加）（図 2D3）では、pH 値はそれぞれ約 4.6（6.2 から始まるΔpH 1.6）, 4.8 （6.2 から始まるΔpH 1.4）, 5.9（6.2 から始まるΔpH 0.3）であった。 この培養物に114AMeV、40Gyの線量を照射すると（図2G、コントロール）、pHは5.7程度まで低下した（6.3から始まるΔpHは0.6）一方、40Gyの線量では（酪酸3.6 g-L-1 を添加した）（図2G1）、7.2 g-L-1 の酪酸を添加）（図 2G2）、40 Gy（10.8g-L-1の酪酸を添加）（図 2G3）では、それぞれ pH 値は約 5.7（6.3 から始まるΔpH 0.6），5.4（6.3 から始まるΔpH 0.9），5.6（6.3 から始まるΔpH 0.7）であっ た。 この培養物に68 AMeV、線量20 Gy（酪酸7.2 g-L-1を添加）を照射すると（図2B2）、pHは約4.4まで低下し（6.3からΔpH 0.9）、線量30 Gy（7を添加）では、pHは約6.3からΔpH 0.9まで低下した（図2C3）。2 g-L-1 の酪酸）（図 2C2）、40 Gy（7.2g-L-1の酪酸を添加）（図 2D2） では、それぞれ約 4.6（6.3 から始まるΔpH 1.7） と 4.8（6.3 から始まるΔpH 1.5） の pH 値であった。 114AMeV、照射量40Gy（酪酸10.8g-L-1添加）（図2E3）では、pHは5.9（6.3から始まるΔpHは0.4）まで低下し、30Gy（酪酸10.8g-L-1添加）（図2F3）と40Gy（酪酸10.8g-L-1添加）（図2G3）ではpH値が約6.1となることが確認された。0（6.3から始まるΔpH）および5.8（6.3から始まるΔpH0.5）であった。
発酵開始54時間における野生型細胞および照射細胞の活性の時間経過と添加酪酸濃度の関数である。 (A)酪酸添加の影響を受けない野生型株の細胞増殖（対照培養）。 (B-D) 照射株（エネルギー68AMeV、線量20, 30, 40Gy）の細胞成長、酪酸添加の影響はない（コントロール培養）。 (E,F) 照射株の細胞増殖（エネルギー 114AMeV、線量 20、30、40Gy）、酪酸添加の影響なし（対照培養物）。 ( A1-A3) 野生型細胞の増殖に対する酪酸添加の影響。 個々のバッチ培養は、グルコース（約42 g-L-1）を含み、3.6 (A1), 7.2 (A2), 10.8 g-L-1 (A3) の酪酸を添加した化学的に定義したP2培地で行った（血清ボトルで実施）。 (B1-B3, C1-C3, D1-D3）照射細胞の増殖に対する添加酪酸の影響（エネルギー114AMeV、線量20, 30, 40Gy）。 個々のバッチ培養は、グルコース（約42 g-L-1）を含み、3.6 (X1), 7.2 (X2), 10.8 g-L-1 (X3) の酪酸を添加した化学的に定義したP2培地で行った（血清ボトルで実施）。 (E1-E3, F1-F3, G1-G3）照射細胞の増殖に対する添加酪酸の影響（エネルギー114AMeV、線量20, 30, 40Gy）。 個々のバッチ培養は、グルコース（約42g-L-1）を含み、3.6（X1）, 7.2（X2）, 10.8g-L-1 （X3）の酪酸を添加した化学的に定義したP2-培地で行った。
これらのpHの違いは各照射株の溶剤形成に伴う時間スイッチを調節している。 このことから、野生株と照射株は培地のpHに強く影響された二相性代謝パターンを示すことが示唆された。 一般的な傾向として、細胞は当初、成長を支えるためにグルコースを消費し、一次代謝産物として有機酸（酪酸、酢酸）を生成・排泄し（酸生成）、それがあるレベルまで蓄積すると培地pHの低下を引き起こした。 このブロス酸度の上昇により、培養が細胞増殖の定常期に達すると、酸の生成は溶媒の生成にシフトした（溶媒生成）。 高pHでは主に有機酸が生成され、低pHでは溶媒の生成が促進される。 予想通り、代謝シフトの性質と溶媒生成の動力学的パターンは、照射株がそれぞれ固有の遺伝的および代謝的特徴を示すことから、株依存的であった。 酪酸は以前、細胞の成長を阻害することが報告されている 。 その結果、野生型株では、細胞増殖が徐々に阻害され、酪酸濃度が 3.6 g-L-1 以上では現実的な増殖は観察されなかった。 しかし、照射株では、酪酸濃度10.8 g-L-1以上では細胞増殖の緩やかな阻害は見られず、現実的な増殖は見られなかった。
酪酸添加の効果をより詳細に調べるために、発酵開始54時間における野生株と照射株の細胞増殖プロファイル（OD測定による）を比較した（図2A1〜図3）。 興味深いことに、12C6+イオン照射のエネルギーと照射量を増加させると、菌株の酪酸耐性が大きく向上することが分かりました。 C. tyrobutyricum ATCC 25755のグルコース代謝経路を図3に示す。 アセチル-CoA、アセトアセチル-CoA、ブチリル-CoAは3つの重要な中間体で、酸生成または溶媒生成の際に異なる生成物を形成する可能性に関して、発酵に特に関心のあるものである。 これらの中間体は、代謝の流れを酸生成または溶媒生成に導く重要な分岐点である。 最後の重要な中間体として、酪酸/酪酸の生成を開始する酪酸-CoAがある。 酪酸はPTBとBKの連続的な活性によって生成される。 両酵素は酸生成時に最も活性が高く、溶媒生成時にその比活性はPTBで2倍、Bukで6倍に低下する。 通常、溶媒生成の誘導には、pH5.5の酸性条件下でin vitro最適となる強いpH依存性活性（最適pH4.7付近）とin vivo（内因性）pH5.5以上が必要であると言われている。 しかし、これらのプロットを比較解析した結果、68 AMeV および 40 Gy 照射株と 114 AMeV および 30 および 40 Gy の線量で照射した株からなる一つの大きなクラスターが明確に存在することが判明した。 図3
Clostridium tyrobutyricumのグルコース代謝経路 …
酪酸生産における12C6+イオン照射の効果
図4B,Eに示すように、照射株の酪酸生産は野生型株に比べて最終生成物濃度、収率ともに大きく改善された。 グルコース最小培地に接種した非照射株（野生株、コントロール）のC. tyrobutyricum培養物は、ほぼ直ちに糖を消費し始め、12〜18時間後に酪酸の生産が始まった（図4A,B）。 グルコース60 g-L-1を含むクロストリジウム増殖培地（CGM）に接種した同じ対照培養物は、照射株と野生株発酵を同じ条件で試験したにもかかわらず、順化に96時間以上要した。 代謝と生産性が最小となる期間が長くなったのは、放射線（異なるパラメータ）により細胞増殖の対数期が遅れたためである（図4C,F）。 照射株の酪酸耐性は大幅に向上し、より多くの酪酸を生産できるようになった。その結果、グルコースを完全に利用し、32 g-L-1を超える酪酸を生産し、細胞バイオマスも同程度のレベルになった。 さらに、酪酸/コントロール比が野生型株の1.114AMeV、40Gy照射株では52、114AMeV、30Gy照射株では1.37、68AMeV、40Gy照射株では1.41、68AMeV、30Gy照射株では1.31となった。 この傾向は、照射した菌株の代謝経路において炭素とエネルギーのフラックスが再分配され、その結果、様々な発酵産物の生産量も大きく変化したことを示している。 なお、発酵中に酢酸の生産量（データなし）が酪酸／酪酸よりもずっと早く横ばいになったことは注目すべき点である。 グルコースが細胞によって消費されなくなると、ブロス中に有機酸や老廃物が蓄積し、細胞の増殖やその他の活動が阻害されるため、発酵が停止したのである。 しかし、照射株は酪酸に対する耐性が高く、このことは照射株を用いた発酵で得られる最終的な酪酸濃度が野生型に比べてはるかに高いことからも示される。 これは驚くべきことではなく、図3に示すように、照射株の酪酸耐性が向上したのは、酪酸PTA/AK経路を通るフラックスが減少したことにも起因していると思われる。 照射株はエネルギー生産と生存をPTA/AK経路に依存しなくなったため、酪酸阻害に対する感受性が低くなったのである。
グルコース（60 g-L-1含有）クロストリジウム増殖培地で37℃、pH 5.5 および 6.0 で増殖した野生型と照射した C. tyrobutyricum の酸およびバイオマス乾燥量生産量を比較したものである。 (A-C) 12C6+ イオン照射（エネルギー 68AMeV、線量 20, 30, 40Gy）がグルコース濃度、酪酸生成量、バイオマス乾燥重量に与える影響。 (D-F) 12C6+ イオン照射（エネルギー 114AMeV、線量 20, 30, 40Gy）が、グルコース濃度、酪酸生成量、バイオマス乾燥重量に与える影響。 (G) C. tyrobutyricumの細胞内タンパク質のSDS-PAGE。 レーン WT：野生型、レーン 1：68AMeV、30Gy照射した細胞、レーン 2：68AMeV、40Gy照射した細胞、レーン 3：114AMeV、30Gy照射した細胞、レーン 4：野生型と114AMeV、40Gy照射した細胞、レーン MW：タンパク質分子量標識。
酢酸生成経路に関連する酵素をコードするack遺伝子とpta遺伝子を誘導すると、酪酸生産が大幅に改善される 。 C. tyrobutyricumに12C6+イオンを照射した後のグルコース代謝の発酵動態と、それに伴うackとpta遺伝子の損傷を理解するために、野生型と照射株のタンパク質発現を調べ、比較した。 図4GにSDS-PAGEの結果を示す。 解析の結果、4つの照射株でタンパク質（分子量、約85kDa）の発現が確認され、レーン4で最もタンパク質の発現量が高いことがわかった。 また、114AMeV、40Gy照射した株では、約106kDaのタンパク質の量が野生株よりはるかに多かった。 これまで、いくつかの微生物由来のAKやPTAの特性評価が行われてきたが、その結果、分子量に大きなばらつきがあった 。 そこで、酸生成経路におけるAK、PTA、PTB の役割をさらに検討するために、酵素活性測定法を実施した（図3）。 C. tyrobutyricumの代謝選択性は成長段階に影響され、指数関数的に成長する培養液は酪酸と酢酸の両方を生産するが、より遅い定常成長速度では酪酸を生産する傾向がある . そこで、各バッチの対数増殖期に培養試料を取り出し、照射株と野生株におけるPTA、PTB、AKの活性を分析した。 照射株（物理的パラメータが異なる）のPTA、PTB、AKの特異的酵素活性を測定し、その相対的活性を野生型株のそれと比較した。 AK活性は、114AMeVおよび40Gy照射株で約47%、114AMeVおよび30Gy照射株で約31%、68AMeVおよび40Gy照射株で約26%低下していた。 114 AMeV, 40 Gy照射株は野生型と比較して、PTB活性は同程度であったが、AK活性は47%と低く、PTA活性は129%と予想外に高かった。 114 AMeV 照射株は AK 活性が大幅に低下していたため、PTA-AK 経路が損なわれ、野生型株よりもグルコースから多くの酪酸（60 g-L-1）を生産したものと思われる。 前述したように、これらの強化や改善は、酪酸阻害に対する耐性が強化されたこと、および照射株における酪酸/酢酸比の増加から明らかなように、ある程度PTA-AK経路を通る炭素フラックスの減少に起因していると考えられる。
12C6+照射によるC. tyrobutyricumの酸収量と増殖への影響
照射後のC. tyrobutyricum ATCC 25755の酪酸生産能力を調べるために、グルコースを主要炭素源として発酵モードでの実験を実施した。 図 5A,B に見られるように、グルコースからの酪酸収量は、野生型株の 0.43g-g-1 から、68AMeV と 30Gy の照射を受けた株では 0.56g-g-1 、0.56Gy と大幅に増加した。また、114 AMeV、30 Gy 照射では 0.63 g-g-1、114 AMeV、40 Gy 照射では 0.66 g-g-1と、野生型の 0.43 g-g-1から、68 AMeV、40 Gy 照射では、0.59 g-g-1、114 AMeV、40 Gy 照射では、 0.68 g-g-1と、大幅に増加した。 なお、ラグフェーズでのグルコース消費を無視した場合、114AMeV、40Gy照射株の酪酸収率はより高くなる（>0.66g-g-1）ことが判明した。 68AMeV、30Gy及び40Gy照射した菌株が生産する酢酸は、野生型から得られる酢酸とほぼ同じであった。 しかし、114 AMeV、30 および 40 Gy の照射を行った菌株の酢酸生産量は、野生型と比較して減少した。 図 5B に示すように、グルコースからの酢酸収量も、野生型の約 0.11g-g-1 から、114AMeV および 30Gy 照射株では約 0.08g-g-1 、114AMeV および 40Gy 照射株では約 0.07g-g-1 と大幅に減少していることがわかった。 それにもかかわらず、酪酸/酢酸比（g/g）は野生型株の3.99から照射株の5.82に上昇し、照射株の代謝経路が酢酸生産よりも酪酸生産を優先するようにシフトしていることが明確に示された。 図 3 に示すように、照射株では AK および PTA 活性が著しく低下していることから、より多くのピルビン酸が酪酸産生経路で異化され、グルコースからの酪酸収率が高くなったものと思われる。 また、酪酸が酸産生経路への早期シフトを促し、それが成長速度の低下に反映された可能性もある。 同じ理由で、照射した試料は、酢酸産生経路（PTA-AK）からのATP産生量が少なく、成長速度が遅くなっている。
C. tyrobutyricum細胞の野生型と照射した場合の酸生成の比較。 (A)野生型細胞と68AMeV，30Gyと40Gyの線量で照射した細胞の線形プロットの傾きから，酪酸と酢酸の生産量を推定した。 (B) 酪酸と酢酸の生産量は、野生型と 114 AMeV、30 Gy と 40 Gy 照射の直線プロットの勾配から推定した。 (C) バイオマス乾燥重量の経時的な動力学的成長プロファイルを、自然対数変換を用いて線形化（積分）した。 60 g-L-1 のグルコースを含む Clostridium 培地で培養した 114 AMeV および 40 Gy 照射細胞について、野生型および照射細胞の最大比増殖率を例示に従って算出した。 BDW、バイオマス乾燥重量。
次に、モデルシミュレーションからの予測に発酵データを適合させることにより、初期グルコースの高濃度（40、60、80および120g-L-1）においてμ maxのプロットが決定された。 バイオマス乾燥重量（BDW）の時間に対する動力学的成長プロファイルの線形化（統合）は、自然対数変換を使用することによって達成された：
ここで、x(t) = 各時刻x 0におけるBDW濃度 ; t = BDW初期濃度 ; μ max = 比増速度の最大値(h-1); 比増速度はμ = (1/x(t)) である。 – (dx/dt)とする。 簡略化のため、すべての細菌が一次速度論モデルに従って、バッチ培養で指数関数的な細胞増殖の法則に従うと仮定した. 細胞の比増殖速度、すなわち時間経過に伴う細胞質量の増加は、異なる成長速度での選択性の変化を表し、発酵プロセスに大きな影響を与える . 急速な細胞増殖はエネルギー需要が高く、酢酸を優先的に生産する。 低い増殖速度では、酢酸よりも酪酸の生産が優先される。 連続発酵の場合、μが低いほど酪酸/酪酸の生産量が多くなる。 μがゼロに近づくと、生産性に振動が生じる。 これらの式から、野生株と放射化株のバッチ式と連続式の成長速度を比較することができる。
このモデルは培地に依存しない。上記のように使用する培地は細胞成長速度と酪酸/酪酸の生産量の両方に影響し、グルコース消費プロファイルが異なれば異なる結果が得られるだろう。 細胞増殖に最適なグルコース濃度をより定量的に把握するため、指数関数的成長期から得られたカイネティクスデータから野生型株と照射株について最大比増殖速度を求め、添加したグルコース濃度に対してプロットしたところ、最大比増殖速度は1.5倍であった。 図5Cに見られるように、グルコース60 g-L-1を含むCGM培地で培養した例に従って、114 AMeV、線量40 Gyで照射した株の最大比増殖率を算出した。 その結果、指数関数的な増殖期に相当する最も良い線形範囲のデータポイントが選ばれた。 3つの実験データポイントの最小要件が満たされない場合、2つの極端なポイント（指数関数的フェーズの最初と最後）のみを説明する代替表現を利用することもあった。 直線の傾き（m = μmax）は、最大比増殖速度（0.213 h-1）を与える。 単項の線形回帰モデル（y = 0.2129x – 2.6457）の修正決定係数はR2 = 0.9765であり、すべてのデータ点が最適な直線上に含まれ、この直線から変動するデータ点はないことが示された。 さらに、各比較成長率は、BDW対時間の対応する半対数プロットの傾きから推定された。 エラーバーは、照射株と野生型について独立した各発酵反復の計算から得られた標準偏差（SD）で表している（元のデータは示していない）。 その結果、これらの照射株は野生型（μ＝0.38〜0.42h-1）と比較して、比増殖速度が著しく低い（μ＝0.38±0.03〜0.21±0.02h-1）ことが明らかとなった。 68AMeV、20〜40Gy、106〜108ions-pulse-1の12C6+イオン照射を用いた場合、それぞれ10, 12, 16時間と特に長いラグフェーズが生じた。 一方、114 AMeV、20～40 Gy、106～108 ion-pulse-1の12C6+イオン照射では、それぞれ12時間、18時間、24時間のラグフェーズとなった。 これらの長いラグフェーズは、異なる照射パラメータと発酵に用いた低密度の植菌量に部分的に起因すると考えられる。 照射細胞の比増殖率が低いのは、高エネルギー・高線量で誘発される損傷により、グルコース代謝により生成されるエネルギー量が低下した結果、細胞にかかる代謝的負担が大きくなったためと思われる。 野生型株と比較して、68 AMeV で 20 Gy 照射した株と 30 Gy 照射した株は、ほぼ同じ比増殖速度 μ=0.42 ±0.0 の成長およびグルコース消費プロ ファイルを示した。03 h-1であった。一方、114 AMeVで30 Gyと40 Gyを照射した株は、ラグフェーズが著しく長く、グルコース消費速度が遅く、比増殖速度がμ.26 ±0.03 h-1（30 Gy）、μ.21 ±0.02 h-1（40 Gy）と大幅に低かった。
先に述べたとおり、アセテートはPTAとAK反応によって合成される（図3）が、後者はATPを供給する反応でもあった。 酪酸の生合成は、2分子のアセチル-CoAがアセトアセチル-CoAに縮合した後、ブチリル-CoAに還元され、PTB反応とBK反応により酪酸に変換されATPが生成される。 照射株（エネルギー114AMeV、線量30Gy及び40Gy）の比増殖率の低下は、ack及びptaの照射損傷によりグルコース代謝時のエネルギー（ATP）生成が少なくなり、細胞に代謝的負荷を与えたことに起因していると考えられる。 また、照射株のグルコースからの BDW は、野生型株とは異なる値であった。 照射株のBDW対時間及び比増殖率のプロットから、炭素とエネルギーのフラックスがこれらの株の代謝経路全体に再分配され、発酵産物の酸生産量にも大きな変化が生じたことが示された
。