Abstract
Haloarcula marismortuiはグルコース上での好気性増殖中に酢酸を生成し、酢酸を増殖基質として利用した。 グルコース/酢酸混合液では、グルコースを優先基質とする二相性増殖が観察された。 グルコースと酢酸の代謝に関連する酵素活性の制御を解析した。 その結果、グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）とADP形成アセチル-CoA合成酵素（ACD）はグルコース消費と酢酸生成の時期に発現が増加し、一方、AMP形成アセチル-CoA合成酵素（ACS）と リンゴ酸合成酵素（MS）は低下していることが明らかにされた。 逆に、酢酸消費時には、ACSとMSの発現が増加し、ACDとGDHの発現が減少した。 また、酢酸非存在下でのペプチド上での増殖では、MSがアップレギュレートされた。 これらのデータから、我々はグルコース誘導性のACDが酢酸生成を触媒するのに対し、酢酸の活性化は酢酸誘導性のACSによって触媒されること、ACSとMSは共に酢酸によって誘導され、グルコースによって抑制されることが明らかになったと結論付けた。
1 はじめに
Haloarcula marismortuiを含む様々な好塩性古細菌はグルコースで増殖し、グルコースは改良型半リン酸化 Entner-Doudoroff (ED) 経由で分解される。 グルコース上で指数関数的に成長する間に、かなりの量の酢酸が生成されることが示されている。 最近の研究から、好塩性古細菌におけるアセチルCoAからの酢酸の生成は、ADP生成アセチルCoA合成酵素（ACD）（アセチルCoA + ADP + Pi⇆ 酢酸 + ATP + CoA）により触媒されることが明らかにされた。 この珍しい合成酵素は、嫌気性超好熱菌を含むすべての酢酸生成古細菌で発見され、原核生物における酢酸生成とATP合成の新しいメカニズムを示している。 嫌気性超好熱性古細菌（Pyrococcus furiosusなど）では、ACDは糖、ピルビン酸、ペプチド代謝中の主要なエネルギー保存反応である。 古細菌の1酵素機構とは対照的に、すべての細菌は、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（PTA）と酢酸キナーゼ（AK）を含む「古典的な」2酵素機構でアセチル-CoAを酢酸に変換する。
H. marismortui, Haloferax volcanii, Halorubrum saccharovorumなどいくつかのハロアルキアも酢酸を基質に増殖すると報告されている。 酢酸の代謝は、アセチル-CoAへの活性化によって開始される。 最近、我々は、ハロアーキアにおける酢酸のアセチル-CoAへの活性化が、AMPを形成するアセチル-CoA合成酵素（ACS）によって触媒されることを初めて証明した（酢酸 + ATP + CoA → acetyl-CoA + AMP + PPi）。 ACSは、3つの生命ドメインに属するほとんどの酢酸利用生物にとって、酢酸活性化の主要な酵素である。 しかし、Corynebacterium glutamicumなどの少数の細菌や、酢酸菌メタン生成古細菌Methanosarcina ssp.は、AK/PTAカップルを介して酢酸をアセチルCoAに活性化するのみである … このように、AK/PTA経路は生体内で可逆的に、すなわち酢酸生成の方向にも酢酸活性化の方向にも働くことが可能である。 一方、ハローアーカイでは、AK/PTAカップルに対応する古細菌のACDは、in vitroでは可逆的な反応を触媒するが、in vivoでは酢酸生成方向に働くことが最初の解析で示唆された。
ハローアーカイにおける酢酸およびアセチルCoA変換酵素の生理的役割をさらに解明し、基質依存的な制御について初めて知るために、H. marismortuiを用いて基質シフト実験を行い、グルコース、酢酸、グルコース/酢酸混合物、ペプチドでの成長を解析しました。 成長過程における酢酸およびアセチルCoA変換酵素であるACDとACS、そして修正ED経路によるグルコース分解の最初の酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼの活性プロファイルを解析した。 また，グリオキシル酸サイクルの主要な酵素であり，ハローアーカイアで働くことが示唆されているリンゴ酸合成酵素の活性を測定した． marismortui のグルコース、酢酸、グルコース/酢酸混合物、ペプチド上での増殖
Haloarcula marismortui は、酵母エキス、カザミノ酸、さらにグルコースや酢酸を含む複合培地で37℃で好気的に増殖させた（既出）。 グルコース/酢酸混合培地では、12.5 mMのグルコースと30 mMの酢酸を添加し増殖させた。 ペプチドの増殖は、酢酸とグルコース非存在下の複合培地上で行った。 成長実験は、2 l発酵槽（fairmen tec、ドイツ）において、スターラー速度500 rpm、圧縮空気処理量600 ml/minで行った。 成長は、578 nmの光学密度（ΔOD578）を測定することによって追跡した。 ΔOD578が1であれば、0.5〜0.6mg/mlのタンパク質含量に相当する。 グルコースと酢酸は .4640>
2.2 細胞抽出物の調製
H. marismortuiの様々な成長段階において細胞（培養物の100-200ml）を収穫し、細胞抽出物を .4640>に記載したように調製した。 2.3 酵素活性の測定
すべての酵素アッセイは、1mlのアッセイ混合物を充填したキュベットを用い、37℃の好気的条件下で実施した。 補助酵素は通常、反応開始の直前に添加し、これらの酵素が速度制限をしないことを確認した。 酵素活性の1単位（1U）は、1分間に消費される1μmol基質または生成物と定義される。
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Acetyl-CoA synthetase (ADP-forming) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) に記載の方法で測定された。C. 6.2.1.1.）は、Ellmanのチオール試薬、5′5-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）を用いて、412nmでチオフェノール酸アニオンの生成を測定することにより、Srereらに従ってアセチルCoAからのPPiおよびAMP依存性HSCoA放出として監視された（ε412= 13.6 mM-1 cm-1 ）。 アッセイ混合物は、100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.25 M KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1 mM DTNB, 1 mM acetyl-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPiおよび抽出物を含んだ。
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Malate synthase (E.C. 4.1.3.2.) はDTNBを用いてセラーノらによる修正アッセイでモニターされました。 アッセイ混合物は、20mM Tris-HCl, pH 8.0, 3M KCl, 30mM MgCl2, 0.1mM DTNB, 0.2mM acetyl-CoA, 0.5mM glyoxylateおよび抽出物を含んだ。
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Glucose dehydrogenase (E.C. 1.1.47) はJohnsenらに従って測定された。 .
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アセテートキナーゼ(E.C. 2.7.2.1.) は .
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Phosphotransacetylase (E.C. 2.3.1.8.) はDTNBでアセチルCoAからのHSCoA放出がPi依存であるとモニターした . アッセイ混合液は100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0.1 mM DTNB, 1.5 mM acetyl-CoA, 5 mM KH2PO4 と抽出液からなる。
3 Results
酢酸およびアセチル-コア代謝に関する酵素の生理機能および調節について調べるために、H． 3.1 酢酸適応細胞のグルコース上での成長
ラグフェーズの後、細胞は指数関数的に成長し、グルコースは完全に消費された。 グルコースの消費と並行して多量の酢酸が生成された。 この時期、GDHとACDの活性はともに上昇したが、酢酸適応細胞で活性を示すACSとMSの活性は完全にダウンした。 定常期になると、排泄された酢酸は完全に再利用され、ACSとMSの活性はともに上昇したが、GDHとACDの活性は低下した（図1）
H. marismortuiのブドウ糖上での生育。 酢酸順化細胞を接種菌として用いた。 ΔOD578（塗りつぶし四角）、グルコース濃度（塗りつぶし三角）、酢酸濃度（塗りつぶし丸）；酵素活性。 ACD（塗りつぶし菱形）、GDH（逆塗りつぶし三角形）、ACS（開丸）、MS（開三角形）
H. marismortuiのブドウ糖上での生育状況。 酢酸順化細胞を接種菌として使用。 ΔOD578（塗りつぶし四角）、グルコース濃度（塗りつぶし三角）、酢酸濃度（塗りつぶし丸）；酵素活性。 ACD（塗りつぶし菱形）、GDH（逆塗りつぶし三角形）、ACS（開丸）、MS（開三角形）
3.ACD（塗りつぶし菱形）、GDH（逆塗りつぶし三角形）、ACS（開丸）、MS（開三角形）。2 酢酸上でのグルコース適応細胞の成長
グルコース適応細胞は酢酸含有培地上で初期（約30時間）、10時間の倍加時間で光学密度（ΔOD578）が1になるまで成長した。この成長段階において酢酸消費は見られず、培地に存在するペプチドで細胞が成長した。 この期間の後、細胞はΔOD578が1.8まで成長速度が低下し、酢酸が完全に消費された。 酢酸消費中、ACDとGDH活性は減少し、グルコース順応細胞では検出できなかったACSとMS活性は増加した。 MS活性の増加はペプチド上での生育中に始まり、ACS活性の増加は酢酸の消費と並行していた（図2）
H. marismortuiの酢酸上での生育． グルコース適応細胞を接種菌として使用した。 図1の凡例に記載したのと同じ記号を用いた。
H. marismortuiの酢酸上での生育状況。 グルコース適応細胞を接種菌として使用した。
3.3 グルコース/酢酸混合物での成長
酵母エキスとカザミノ酸に適応したH. marismortuiの細胞をグルコースと酢酸の両方を含む培地に移し替えた。 この細胞は、第一のグルコースと第二のアセテートを順次利用する二相性増殖を示した。 最初の成長段階で、細胞はΔOD578が4.0まで成長し、グルコースが消費された。 グルコースの消費と短いラグフェーズの後、細胞は第二の成長期に入り、そこでは酢酸が代謝され、細胞は最終的にΔOD578が5.2まで成長した。 グルコース消費と並行して行われた最初の成長期では、ACDとGDH活性が上昇したが、ACS活性は検出されず、MS活性は完全にダウンレギュレートされた。 酢酸の消費と並行して行われた第2の成長期では、ACSとMSの活性が上昇し、ACDとGDHの活性が低下した（図3）。
H. marismortuiのグルコース/酢酸混合液での成長。 グルコースと酢酸の非存在下で複合成分に適応した細胞を接種菌として使用した。 図1の凡例に記載したのと同じ記号を用いた。
H. marismortuiのグルコース/酢酸混合物上での成長。 グルコースと酢酸の非存在下で複合成分に適応した細胞を接種菌として使用した。 図1の凡例に記載したのと同じ記号を用いた。
3.4 ペプチド上のグルコース適応細胞
グルコース適応細胞をグルコースと酢酸の両方の不在下で0.25%酵母エキスと0.5%カザミノ酸を含む培地に移行させた。 この細胞は13時間の倍加時間でΔOD578が2.5まで増殖した。 酢酸の生成は検出されなかった。 指数関数的な増殖の間、ACD（60から20 mU/mg）とGDH（80から40 mU/mg）は減少し、当初検出できなかったMS活性は20 mU/mgまで増加した。 ACS活性は指数関数的成長期には検出できなかったが、定常期には増加した（13 mU/mg）。
4 Discussion
この論文では、H. marismortuiにおける酢酸およびアセチルCoA変換酵素（ACD、ACS）の生理的役割を解析し、GDHとMSと同様にこれらの酵素の基質特異的制御について最初の証拠を示した。 その結果、H. marismortuiのアセテート生成はACDによって触媒され、「オーバーフロー」代謝の一部であることがわかった（図1、図3）。 逆に、酢酸またはペプチドを用いた生育では、両活性は減少した。 これらのデータとAK/PTAの非存在は、ハロアルクラにおける酢酸の形成がACDによって触媒されることを示す。 H. marismortuiにおける酢酸生成の生理的役割と、グルコース上での好気的成長中のその制御は理解されていない。酢酸生成は、大腸菌や枯草菌など様々な細菌である程度詳細に研究されてきた「オーバーフロー」代謝の一部かもしれない。 H. marismortuiと同様、両菌とも過剰なグルコースによる好気的増殖中に酢酸を排泄し、定常期に再利用している。 酢酸の排泄は、解糖速度が後続の経路、例えばクエン酸サイクルやグルコースの完全酸化に必要な呼吸の速度を上回った場合に起こると推測されている。 このような条件下では、アセチル-CoAは酢酸に変換され、排泄される。 大腸菌と枯草菌の転写解析では、グルコース特異的に解糖系遺伝子が誘導され、クエン酸サイクルや呼吸の遺伝子が抑制されることが示されている。 最近、好塩性古細菌H. volcaniiにおいても、同様のグルコース特異的な転写調節、すなわち、改良型Entner-Doudoroff経路の解糖系遺伝子のアップレギュレーションと、いくつかのクエン酸サイクルおよび呼吸の遺伝子のダウンレギュレーションが報告されている。 したがって、ハロアーキアではグルコース特異的なオーバーフロー代謝が行われ、その結果、酢酸が生成される可能性がある。 E. coliとB. subtilisにおける酢酸生成はPTAとAKを介した細菌由来の2酵素機構であるが、Haloarculaにおける酢酸生成は古細菌由来の1酵素機構であるACDによって触媒される。 大腸菌と枯草菌では、グルコースがptaとackをコードする遺伝子を誘導することがわかり、解糖と酢酸生成の協調的な制御が示唆された。 これまで、古細菌H. marismortuiにおける酢酸生成ACDの転写調節機構は解析されていない。 しかし、GDHとACD活性の協調的な制御は、修正Entner-Doudoroff経路による解糖とACDによる酢酸生成の両方に同様のグルコース特異的な転写制御があることを示唆している。
ペプチド上での好気性成長中にH. marismortuiは酢酸を生成せずACD活性はダウンレギュレートされていた。 この点で、Haloarculaは細菌E. 大腸菌は、ペプチドを用いた好気性増殖の際に、「オーバーフロー」代謝の過程で大量の酢酸を形成する。 H. marismortuiはまた、糖とペプチドの両方で嫌気性増殖中にACDによって大量の酢酸を形成する嫌気性超好熱性古細菌P. furiosusや他の嫌気性超好熱性古細菌とは異なっている。 P. furiosusの嫌気性ペプチド・糖発酵では、ACDによる酢酸生成は基質レベルのリン酸化によるATP生成の主要部位である。一方、H. marismortuiの好気性糖・ペプチド分解では、ほとんどのエネルギーは呼吸鎖の電子輸送リン酸化によって保存され、ACDによる酢酸生成はあまり重要ではないか必要でないと考えられている。 H. marismortuiのアセチルCoAへの酢酸活性化はACSによって行われる
このことは、酢酸消費と並行してACS活性が上昇していることから結論づけられた（図1、2、3）。 酢酸の活性化におけるACDの役割は、酢酸の消費期間中にACDがダウンレギュレートされていたことから否定された。 このように、ハロアルクラのACDは、in vivoでは酢酸生成の方向にのみ働いていることがわかった。 また、ACSは厳密に制御されている細菌では最も一般的な酢酸活性化メカニズムである。例えば、大腸菌や枯草菌では、acs遺伝子は酢酸で誘導され、グルコースで抑制される … ハロアルキュラでは、酢酸によるACS活性のアップレギュレーションとグルコースによるダウンレギュレーションは、バクテリアで報告されたのと同様の転写レベルでの制御を示唆している。 大腸菌や枯草菌とは対照的に、細菌C. glutamicumは酢酸誘導性のAK/PTA経路によって酢酸を活性化する。
H. marismortuiではグリオキシル酸サイクルの主要酵素であるMSの活性がACSとともに酢酸消費時に上昇し、ACSと無呼吸グリオキシル酸サイクルが酢酸特異的に協調制御されていることが示唆された。 MSとACSの活性はグルコースによって抑制された。 大腸菌やC. glutamicumを含むいくつかの細菌において、酢酸活性化酵素（上記参照）およびグリオキシル酸経路の遺伝子が酢酸特異的に協調的に誘導されることが報告されている。 しかし，酢酸非存在下でペプチドを用いた指数関数的な増殖では，ACS活性よりもMS活性の方が高くなることから，MSの制御は酢酸に限定されず，より複雑であることが示唆された． ペプチド代謝におけるMS（およびグリオキシル酸サイクル）の役割は、多くのアミノ酸がアセチル-CoAに分解され、同化のためにグリオキシル酸経路が機能する必要があるという事実で説明できるかもしれない。 また、ペプチドを用いた増殖の際に定常期に観察されるACS活性の増加は、今のところ説明できないが、定常期細胞の一般的なストレス反応によるものかもしれない。
4.3 H. marismortuiにおけるグルコース特異的異化抑制
Haloarcula marismortuiではグルコースを優先基質にグルコース/酢酸混合物で二重成長を示し、グルコースが酢酸利用の何らかの異化抑制を行うことが示唆されている。 グルコース特異的異化抑制機構は、これまで古細菌では解析されていない。 細菌では、グルコースによる炭素異化抑制の分子的基盤が、大腸菌や枯草菌などで詳細に研究されている。 C. glutamicumのグルコース/酢酸混合物での増殖では、酢酸とグルコースを同時に消費する単相性増殖が報告されているが、Azotobacter vinelandiiでは酢酸が優先基質である。 これらの特徴の背後にある制御原理は現在調査中である。
転写レベルでの酢酸およびグルコース代謝に関連した酢酸形成および酢酸活性化酵素、ACDおよびACSの提案された基質特異的制御を立証するためにはさらなる研究が必要である。 これらの研究は、H. marismortuiからのACDとACSの精製とコード化遺伝子の同定を必要とし、現在進行中である。
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著者ノート
編者。 ディーター・ヤーン
氏