RP-HPTLC/デンシトメトリーによるバルクおよびカプセル中のThiocolchicosideの安定性研究

要旨

Thiocolchicosideのデンシトメトリー分析のための新しい安定性を示す逆相高速薄層クロマトグラフィー（RP-HPTLC）法を開発し検証を行った。 シリカゲル60 RP-18 F254Sをプレコートしたアルミニウム板を固定相とし，メタノール：水（70：30）を移動相としてクロマトグラムを作成した。 チオコクリコシドのコンパクトバンドは377 nmの吸収波長で観測されました。 100-600 ngの濃度範囲でピーク面積に対する検量線( )の直線回帰データが得られました。 検出限界（LOD）は9.77 ng，定量限界（LOQ）は29.63 ngであった。 本薬剤を酸性およびアルカリ性の加水分解，酸化，光分解，乾熱条件下で測定した。 分解生成物のピークは標準薬剤のピークとよく分離し，有意な差が認められた。 統計解析の結果，確立したRP-HPTLC法は製剤中のthiocolchicosideの定量に再現性，選択性，正確性を有することが証明された。 また，本法は薬物とその分解物の分離が可能であり，安定性を示す分析法であると考えられた。 はじめに

チオコルコシドは化学的には2-demethoxy-2-glucosidoxythicolchicineである（図1）。 チオコルコシドは、植物Gloriosa superbaに存在する天然由来のグルコシドであるコルチコシドの半合成硫黄誘導体である。 臨床的には、筋弛緩作用、抗炎症作用、鎮痛作用があるとして使用されている。 チオコルキコシドの単体およびロルノキシカムとの合剤における生物学的同等性を評価するためのLC-MS-MS法はほとんど確立されていない。

Figure 1

チオコルコシドの化学構造。

バルクおよび製剤中のチオコルコシド単独の定量には、LC-ESI-MS RP-HPLCおよびUV-分光光度法などの分析方法が確立されています。

チオコルコシドは他の多くの薬剤と組み合わせて使用できるため、配合剤中のチオコルコシドの定量には、UV-Spectrophotometric、RP-HPLC、HPTLC法などのいくつかの方法が検討されています。

ICH (International Conference on Harmonization) のガイドライン「Stability Testing of New Drug Substances and Products」では、活性物質の固有の安定特性を明らかにするためにストレステストを実施することが要求されています。 理想的な安定性表示法は、標準薬とその分解物を分解するものである。 従って、親化合物から分解成分を最適に分離できるような、信頼性が高く、迅速な測定法の開発が必要である。 しかし、これまでチオコールキコシドの安定性を示すRP-HPTLCによる定量に関する文献はない。 本稿では，原薬の純度および製剤の安定性評価のために，分解物の存在下でのチオコルコシドの同定および定量分析条件を確立することを目的とする。 ICHガイドラインに準拠したバリデーションを行い、チオコールキコシドの定量分析における安定性を示すRP-HPTLC法の妥当性を確認した。

2 実験

2.1. 化学物質と試薬

Thiocolchicoside は Ajanta Pharma.社からギフトサンプルとして入手した。 Ltd., Mumbai, Indiaからギフトサンプルとして入手した。 HPLCグレードのメタノール、HCl、NaOH、H2O2はMerck Chemicals, Indiaから購入した

2.2. HPTLC装置

CAMAG Linomat 5-sample applicator (CAMAG Muttenz, Switzerland) を用いて、標準薬とサンプルを幅6 mmのバンド状にスポットし、150 nL/秒の一定の速度で塗布した。 プレートはメタノールで予備洗浄し、クロマトグラフィーの前に100℃で10分間活性化した。 クロマトグラフィーは、シリカゲル60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Germany) でプレコートしたアルミニウムプレートで行った。 移動相としてメタノール：水（70：30 v/v）を用いたリニアアセンディング展開は、20×10cmのツイントラフガラスチャンバー（CAMAG Muttenz, Switzerland）で行った。 移動相のチャンバー飽和時間は、室温（28±2℃）で30分間とし、最適化した。 クロマトグラムのランの長さは約80mmであった。 プレートの現像時間は25分であった。 現像後、エアードライヤーで通風乾燥した。 スポットの検出は、CAMAG TLC Scanner 3を用い、winCATSソフトウェアバージョン1.3.0で吸光モードにて377 nmで行われた。 放射源は重水素ランプであった。 スリット寸法は6mm×0.45mm、スキャン速度は20mm/sec.でした。 標準液の調製

チオコクリコシドの1 mg/mLメタノール標準液

2.4.標準液の調製

2.4.標準液の調製

1 mg/mLの標準溶液を調製した。 0.2～1.2mLの標準溶液を6個の10 mLフラスコに移し、メタノールで定容した後、0.2～1.2mLの標準溶液を加えて直線性を検討した。 この溶液から5μLずつRP-HPTLCプレート上に滴下し、1バンドあたり100〜600 ngの濃度になるように調整した。 ピーク面積と薬物濃度から検量線が作成された。 試料溶液の調製

カプセル中のチオコルコシド含量を測定するため、20カプセル（MYORIL、ラベル表示：1カプセルあたりチオコルコシド8 mg）を秤量し、カプセルの中身を取り出し、その平均重量を測定した。 チオコルコシド8 mg相当量をメタノール50 mLの入った100 mLメスフラスコに移し、10分間超音波処理した後、定容し、Whatmann No.41 フィルターペーパーでろ過した。 5 mLをメタノールで10 mLに希釈し、得られた溶液5 μLをRP-HPTLCプレートに塗布してチオコールキコシドを定量した。 プレートの現像とスキャンは前述と同様に行いました。 メソッドバリデーション

ICHガイドラインに基づき、以下のパラメータについてメソッドのバリデーションを実施しました。

2.6.1. Precision

試験濃度(thiocolchicoside 1バンド400 ng)の6反復で試料塗布とピーク面積の測定を実施しました。 チオコルコシドの推定における日内変動は、3種類の濃度(200、300、500 ng/バンド)で3反復して実施しました。

2.6.2. 検出限界（LOD）および定量限界（LOQ）

検出限界および定量限界を決定するために、検量線の線形範囲の下部のthiocolchicoside濃度を使用しました。 標準溶液からthiocolchicoside 100, 120, 140, 160, 180, 200 ng per bandをRP-HPTLCプレートに3連で塗布し、LODとLOQは以下の式で算出した。ここで””はノイズ対策として薬剤のピーク面積の標準偏差 (), “”は対応する検量線の傾きである

2.6.3. 特異性

薬物の標準品と試料を分析し、本法の特異性を確認した。 試料中のチオコルコシドのバンドを標準品と比較し、バンドの値及びスペクトルを確認した結果、チオコルコシドであることが確認されました。 また、peak-start()、peak-apex()、peak-end()の3段階のスペクトルを比較し、thiocolchicosideのピーク純度を確認しました。 7055>

2名の分析者が同じ環境条件で400 ngのチオコクリコシドを分析することにより、本法の耐久性を評価した。 Accuracy

Thiocolchicoside sample solution (200 ng per band) をプレート上に9バンド塗布し、サンプル濃度 (200 ng per band) の80、100、120% (160, 200, 240 ng per band) で既知量のThiocolchicosideを3連装して提案法により再分析を実施した結果。 これは、製剤中の異なる濃度での薬物の回収試験を評価するために実施されました。

2.6.6. ロバスト性

移動相組成、移動相量、塗布から展開までの時間、展開からスキャンまでの時間を少しずつ変化させ、結果への影響を検討しました。 移動相はメタノール:水(72 : 28 v/v)とメタノール:水(68 : 32 v/v)の異なる組成を試し、クロマトグラムを測定した。 プレートはメタノールで前洗浄し，クロマトグラフィー前に80±5℃で2，5，8分間活性化した。 本法の頑健性は、同一スポットを6回繰り返し測定することにより確認した（チオコルコシド1バンドあたり400 ng）。 Thiocolchicosideの強制分解

2.7.1. 酸および塩基による加水分解

正確に秤量した10 mgのチオコロシコシドをそれぞれ10 mLの1.0 M HCl および 0.5 M NaOHのメタノール溶液に溶解し、光の影響を受けないように60℃、暗所で30分間加熱還流させました。 上記溶液から1.0 mLを採取し、中和した後、メタノールで10 mLまで希釈した。 得られた溶液をRP-HPTLCプレート上に3連で塗布した（各5μL、すなわち1バンドあたり500 ng）。 クロマトグラムの現像とスキャンは上記のように行った。 酸化分解

酸化分解は、チオクロキコシド10mgを1% v/v H2O2および3% v/v H2O2のメタノール溶液10mLにそれぞれ正確に溶解し、室温で30分間暗所に置いた後、1% v/v H2O2のメタノール溶液にそれぞれ溶解した。 30分後、上記溶液からそれぞれ1.0 mLを採取し、メタノールで10 mLまで希釈した。 得られた溶液を3枚組のRP-HPTLCプレートに塗布した（各5μL、すなわち1バンドあたり500ng）。 クロマトグラムは上記のように現像し、スキャンした

2.7.3. 乾熱分解

正確に秤量したチオコルコシド10mgを70℃のオーブンで8時間保存した。 これをメタノール入りの10 mLメスフラスコに移し、定格量にした。 上記溶液1.0 mLを採取し、メタノールで10 mLまで希釈した。 得られた溶液をRP-HPTLCプレートに3連で塗布した（各5μL、すなわち1バンドあたり500ng）。 クロマトグラムは上記のように現像し、スキャンした

2.7.4. 光分解

正確に秤量した10 mgのチオコルコシドを10 mLのメタノールに溶解し、24時間光照射を続けた。 この溶液を1.0 mL採取し、メタノールで10 mLに希釈した。 得られた溶液をRP-HPTLCプレートに3枚ずつ塗布した（各5μL、すなわち各バンド500 ng）。 クロマトグラムの現像とスキャンは前述と同様に行った。 結果と考察

3.1. 最適な移動相の開発

thiocolchicosideの分離に適した移動相を選択するために、極性の異なる溶媒を含む移動相を用い、異なる濃度レベルで数回の測定を実施しました。 その結果、メタノール:水(70 : 30 v/v)の移動相では0.60 ± 0.02のシャープで明瞭なピークが得られた(図2)。 このバンドは、室温で30分間移動相を飽和させたときに確認されました。

3.2. 検量線

検量線()の直線回帰データは、各バンド100〜600 ngの濃度範囲で良好な直線関係を示しました。 直線回帰式は , = 0.9984 (図3)でした。

3.3. メソッドのバリデーション

開発したメソッドは、ICHガイドラインに従ってバリデーションを行いました。

メソッドの精度はピーク面積の%相対標準偏差(% RSD)で明らかにされました。 また，ピーク面積の相対標準偏差(% RSD)で測定した結果(Table 1)は，キャリブレーションプロットの最下点の傾きから測定精度を表すことができました。 また，LODおよびLOQはそれぞれ9.77 ngおよび29.63 ngであり，本法は十分な感度を有していることが確認されました。

回収率は、ICHガイドラインに従い、試験濃度の80%、100%、120%で実施しました。 回収率は99.92-100.04%でした。 薬物の添加量、測定量および回収率を（Table 2）に示します。 チオコルコシドのピーク純度は、バンドのピークスタート、ピークアペックス、ピークエンド位置のスペクトルを評価することにより確認され、(, )=0.9995, (, )=0.9986 であり、本法の特異性が示されました（図4）。 また、標準品とカプセル製剤から抽出した薬物の間には良好な相関（=0.9989）が得られました。 クロマトグラフィー条件を意図的に変更し、クロマトグラムへの影響を観察することで、本法の頑健性を実験した。 各パラメーターについてピーク面積の標準偏差を算出し，% RSD は 2%未満であることが確認された。 RSD 値が低いことは，メソッドの頑健性を示すものであり，結果を （Table 3）に示します。 このメソッドの頑健性は，異なる分析者により検証され，%RSD は 0.57 と 0.58 であり，このメソッドが頑健であることを示しています。

3.4. 市販製剤の分析

カプセル剤から抽出したチオコキコシドはクロマトグラムで0.60 ± 0.02の単一スポットを示した。 平均薬物含量はラベル表示の100.27%であり、0.88%のRSDであった。 安定性-指示特性

3.5.1. 酸性分解

チオコルコシドを1.0 M HCl (60°C, 30 min)で強制分解したところ、不安定で、値0.33と0.71に二つのピークを追加した (Figure 5(a))． 分解物のスポットはチオコクリコシドのスポットとよく分離していた。

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

RP-…(a) 酸性加水分解（1M HCl）で分解したチオコクリコシドから得られたHPTLCクロマトグラム。 (b)アルカリ加水分解（0.5 M NaOH）、（c）酸化ストレス（1% v/v H2O2）、および（d）酸化ストレス（3% v/v H2O2）です。 Basic Degradation

Thiocolchicoside は 0.5 M NaOH で 60℃、30 分間のアルカリ加水分解を行うと不安定になることがわかりました。 図5(b)に示すように、薬物は0.72のピークを示し、チオコクリコシドは0.60に留まった。 分解物のスポットは薬物のスポットとよく分離していた。

3.5.3. 酸化分解

Thiocolchicoside は硫黄原子をもっており、H2O2によって酸化されやすい。 1%v/vのH2O2で処理すると、0.60のチオコクリコシドが残る一方で、0.38、0.46、0.70の3つのピークが追加観測された（図5（c））。 3%v/vのH2O2で酸化分解すると、チオコルコシドは完全に分解され、それぞれ0.58と0.64の2つの主要ピークと0.70の1つのピークが観測された（図5（d））。 1 M HCl, 0.5 M NaOH, 1% v/v H2O2で分解して回収したチオコクリコシドとチオコクリコシド標準品のピークスタート、ピークアペックス、ピークエンド位置でスキャンしたピーク純度スペクトルは（図6）に示すとおりであった。 ストレステストの結果、本法はチオコルコシドに対して高い特異性を有することが明らかになった。 分解生成物は親化合物から全く目立たなかった。 また、光分解および熱分解において、薬物溶液を日光にさらして分解することは確認されず、いずれの条件においても薬物は安定であることが示された。 チオコルコシドの強制分解試験の結果を(Table 4)にまとめた。

ストレス条件 温度 % Recovery () Thiocolchicoside peak- Thi-Chicoside Thi-Chicoside Thiocolchicoside Thiocolchicoside1 peak-2 peak-3 1.0 M HCl 60°C 78.00 (0.60) 8.22 (0.33) 13.78 (0.71) 0.5 M NaOH 60°C 85 (0.60） 15（0.72） – 1％ v/v H2O2 RT 67.50（0.60） 2.18 (0.38) 10.20 (0.46) 20.12 (0.70) 光分解-昼光（8時間/日） RT 92.94 (0.60) – – 乾熱 70℃ 98.12 (0.60) – –

rt: Room Temperature.

Table 4

強制分解試験。

Figure 6

1M HCl, 0.で分解して回収したチオコクリコシドのピーク純度スペクトル.5 M NaOH, 1% v/v H2O2、分解物、チオコルコシド標準品をピークスタート、ピークアペックス、ピークエンドの位置でスキャンした。 結論

本研究では、チオコルコシドの固有の化学安定性を明らかにするために強制分解を実施した。 この目的のために、RP-HPTLC法を開発した。 開発した方法は，簡便，迅速，選択的，高感度であり，バルク材およびカプセル剤中のthiocolchicosideの定量に適していることが確認された。 また，チオコールキコシドは酸や塩基による加水分解および酸化に対して感受性があることが判明した。 本法は安定性を示す方法であるため、関連する不純物を検出することにより、様々な供給元から入手可能な薬剤の純度を決定するために使用することができる。 さらに、薬剤中に存在する不純物は、薬剤の加工および保存中の加水分解または酸化に起因する可能性があると結論づけることができる。

利益相反

著者らは、利益相反がないことを宣言する。

謝辞

著者らは、この研究作業を行うために必要な設備を提供してくれたインド、Shirpur (M.S.) の R. C. Patel Institute of Pharmaceutical Education and Researchに感謝している。