TRPV3およびTRPV4イオンチャネルの2-APB感受性を決定する2つのアミノ酸残基

Results

Identification of Mutations Specifically Affecting 2-APB Responses.

エラープリローンPCRにより生成した各クローン平均2.5変異のある約14000cDNA構築物から成るマウスTRPV3変異ライブラリーを審査した。 変異体コンストラクトをヒト胚性腎臓（HEK293）細胞にトランスフェクトし、熱（42℃）、25 μM 2-APB、1.75 mM camphorによって引き起こされるカルシウム応答を蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR）でモニターした。 我々は最近、TRPV3の熱活性化に特異的に必要な残基を同定したことを報告した(20)。 ここでは、2-APBと樟脳のデータセットに注目し、化学反応に特異的に必要な残基を同定した。

具体的には、一方の化学物質で正常な反応を示し、他方で活性化が著しく低下するクローンを選択した（選択基準については、方法を参照されたい）。 陽性クローンを摘出し、再成長させ、各刺激に対する完全な用量反応曲線を測定し、EC50値を算出した(Methods参照)。 7つの変異体クローンが、2-APBを特異的に欠損していることが確認され、配列が決定された。 驚くべきことに、7つのクローン全てに2つの残基のうち1つに変異があった。 最初のヒスチジン（H）426は、細胞質N末端領域、アンキリンと膜貫通ドメインの間に存在する。 我々はスクリーニングにより、H426の4つの異なる置換を同定した（表1）。 2つ目のアルギニン（R）696は、TRPチャネルの保存ドメインであるC末端の細胞質TRPボックス（IWRLQR）内に存在している（2, 3）。 この残基の3つの変異は、同じようにアルギニンからリジンへの置換が密接に関連している。 7つの変異はすべて2-APB反応に深刻な障害をもたらし、樟脳反応には影響を与えなかった（表1）。 いくつかのカンファー欠損クローンも同定されたが、それらは比較的微妙な変異であり、カンフルのEC50値を≈2倍以下にシフトさせた（データは示されていない）。 このため、本研究では、特に>10倍の2-APB欠損を引き起こす2残基に焦点を当てた。

Initial Electrophysiological Characterization of TRPV3-H426 and TRPV3-R696 Channels.

FLIPR is an indirect way of measuring ion channel activity.Interactivation of TRPV3-R696 Channels.FlIPR is an indirect way of measuring ion channel activity. FLIPRの結果を確認するため、パッチクランプ法を用い、2-APB（1μM〜3mM）または樟脳（0.3〜20mM）を低濃度から高濃度まで個別に浴用したときの野生型マウスTRPV3、TRPV3-H426N、TRPV3-R696Kの全細胞電流を測定した（図1、図S1）。 濃度依存的に，2-APBは野生型TRPV3を導入したHEK293細胞の電流を活性化し，平均EC50値は25.9 ± 0.3 (nHill = 2.3) および 36.8 ± 3.3であった．6 μM (nHill = 3.3)、それぞれ+100 mVと-100 mVで（図1A；図S1A）；2-APBは100 μMまでTRPV3-H426NをトランスフェクトしたHEK293細胞で測定可能な電流を誘導することがなかった。 しかし、野生型TRPV3にとって飽和する2-APBの濃度（0.3〜3 mM）は、この変異体において濃度依存的に電流を活性化することができた（図1A；図S1A）。 その結果，TRPV3-H426Nは2-APB依存性活性化のEC50が>10倍シフトし，応答は飽和に達することはなかった． 並行して行った実験では、樟脳は野生型TRPV3を導入したHEK293細胞においても濃度依存的に電流を活性化し、EC50値は+100 mVと-100 mVでそれぞれ6.7 ± 0.1 (nHill = 7.8) と 7.0 ± 0.1 mM (nHill = 8.4) であった。 重要なことは、TRPV3-H426NをトランスフェクトしたHEK293細胞では、樟脳に対する野生型と同様の反応が観察され、この変異体では樟脳の活性化は変化していないことが確認された（図1A；図S1B）。

TRPV3-H426NとTRPV3-R696Kの電気生理学的特性評価。 (A)野生型とH426N変異体の2-APBと樟脳の濃度応答曲線から，2-APBの応答は消失しているが，樟脳による応答は消失していないことがわかった。 (B) R696K 変異体では、2-APB-活性化応答も特異的に影響を受けたが、樟脳-活性化応答は野生型 TRPV3 と R696K 変異体の間で同様であった。 R696K 変異体では、急性ピーク応答を用いて EC50 値を算出した。 エラーバーはSE。 2-APB反応について：野生型TRPV3ではn = 17、H426N変異体ではn = 9、R696K変異体ではn = 6。 7291>

ホールセルパッチクランプ実験では，2-APBはTRPV3-R696Kの最小限の活性化も誘導した． 100 mVでは，2-APBはこの変異型チャネルを発現するHEK293細胞を≈3 μMで活性化し始め，30 μMで飽和し，EC50は10.0 ± 1.3 μM (nHill = 2.1) であった． より高濃度の2-APB（>30μM）は、2-APBのウォッシュアウト後に「オフレスポンス」を伴う脱感作電流を誘発したが、この現象については以下に詳述する。 しかし、-100 mVでは、2-APBは1 mMでもR696K変異体チャネルを活性化できなかった（図1B; 図S1A）。 1 mMでの-100 mVでの最大2-APB応答は-2.3 ± 1.4 pA/pF (n = 6) であり、これは野生型TRPV3チャネル (-482.1 ± 69.2 pA/pF at 300 μM, n = 17) より著しく小さく (>10-fold) 、2-APBによって引き起こされる最大チャネル応答がTRPV3-R696K突然変異体で減少することが示唆された。 しかしながら、樟脳はTRPV3-およびTRPV3-R696KをトランスフェクトしたHEK293細胞に対して同様の応答を活性化した（図1B；図S1B）。 その結果、TRPV3-H426N変異体およびTRPV3-R696K変異体は、2-APBに対する反応性を欠くが、カンファーに対する反応性によって検証されるチャネル機能全体には影響がないという、我々のスクリーニング結果を確認した

次に我々は、H426とR696のどの側鎖の特性が2-APBのTRPV3活性化に重要であるかと考えてみた。 426位と696位をそれぞれ他のアミノ酸に変異させ、2-APBと樟脳のFLIPR用量反応曲線を測定したところ、2-APBによるTRPV3活性化にはH426とR696の側鎖の特性が重要であることがわかった。 興味深いことに、すべてのH426変異体は2-APBに対する反応が低下し、EC50値は強く（>10倍）増加した（Table S1）。 ほとんどの変異体は通常のカンファー反応を示したが、ヘリックスを破壊するプロリン置換体ではカンファーEC50が≈2倍増加することがわかった。 このデータは、この位置での2-APBの欠損をもたらす4つの異なる置換を同定した我々の一次スクリーニングの結果と一致する。 芳香族側鎖F, T, Wを持つ変異体チャネルは、カンファーにも2-APBにも反応しなかった。 しかし、ほとんどのR696変異体は2-APBへの応答が減少したが、最大カンファー（20 mM）応答も減少した。このことは、これらの変異がチャネル全体の発現や機能に影響を及ぼしていることを示している（表S2）。 この結果は、リジン置換のみがこの残基で2-APBに特異的に必要であると同定された一次スクリーニングからの最初の結果とも一致する。 R696Fもまた、最大限のカンファー反応にわずかな影響を受けたものの、2-APB特異的な欠損を示した。 R696D、R696G、R696N、R696P、R696S、R696Tは、pcDNAベクター導入細胞と比較して、2-APBにもカンフルにも大きな応答を示さなかった。

電圧依存性応答は2-APB変異体でも維持された

電圧依存性はTRPチャネルの活性化とゲーティングに重要な役割を持っていることがわかってきた (1, 10-12, 21). 化学的刺激物（例えば樟脳や2-APB）がない場合、野生型TRPV3をトランスフェクトしたHEK293細胞では-120から+180mVの電圧ステップ（20mVステップ）は電流を活性化せず、TRPV3は（TRPV1やTRPM8と異なり）ここで試験した範囲では電圧だけでは活性化しないことが示されている（20、22）。 しかし、30μMの2-APB存在下では、電圧依存的な電流が活性化された（図S2A）。 予想通り、TRPV3-H426Nを30μMの2-APBで処理した場合、検出可能な電圧変調電流は見られなかった（図S2B）。 しかしながら、6mMの樟脳は、野生型TRPV3（V1/2は81.3±2.6mV）（図S2 A及びD）及びTRPV3-H426N（V1/2は81.3±2.5mV）（図S2 B及びD）を発現するHEK293細胞において電圧依存性の電流を誘発させた。 TRPV3-H426Nと同様に、30μMの2-APBで処理した場合、TRPV3-R696Kには検出可能な電圧変調電流が存在しなかった（図S2C）。 しかし、樟脳は81.1 ± 5.4 mVのV1/2を持つ電圧依存性電流を活性化した（図S2 CおよびD）。 これらの結果は，TRPV3-H426NとTRPV3-R696Kでは電圧変調が損なわれていないことを示しており，これらの変異チャネルにおける2-APBに対する応答の低下は電圧依存性の喪失が原因であるとは考えにくいことを示唆している。 そこで，TRPV3-H426NとTRPV3-R696Kのクローンにおいて，温度活性化が変化するかどうかを検討した． 野生型 TRPV3、TRPV3-H426N、TRPV3-R696K 変異体をトランスフェクトした HEK293 細胞を FLIPR アッセイで温度（25～42 ℃）活性化を測定したところ、TRPV3-R696K 変異体では温度活性化が見られなかった。 TRPV3-H426Nの熱応答は、野生型TRPV3の熱応答と同等かわずかに大きかった（n = 4実験）ことから、2-APB-活性化と熱活性化は分離できることが示唆された（図S2E；およびデータ示さず）。 しかし、TRPV3-R696Kの熱応答は野生型と比較して非常に小さく（n = 3実験）、この変異体は2-APB活性化を特異的に変化させていないことが示唆された（図S2E）。

TRPV3-R696Kを導入したHEK293細胞における2-APB反応の興味深い特徴は、>30μM 2-APBでの速い脱感作と高濃度での2-APBに対するオフ反応である（図 S3）。 この現象は、化学物質や熱の反復／連続刺激に反応して感作する野生型TRPV3とは対照的である（14, 16）。 TRPV3の感作のメカニズムは、このチャネルのカルシウム阻害の喪失であると提唱されている（22）。 TRPV1 や TRPA1 などの他のほとんどの TRP チャンネルの化学物質や温度刺激に対する脱感作も、細胞外カルシウムに依存することから (24, 25)、TRVP3-R696K の 2-APB による脱感作反応に細胞外カルシウムが関与しているかどうかを検証することにした。 驚いたことに、細胞外カルシウムが存在しない場合、100 μM 2-APBはTRPV3-R696Kにおいて強固で野生型に近い内向きおよび外向き電流を活性化した（TRPV3-R696Kの電流密度：755.7 ± 200.0 pA/pF at +100 mV, -641.2 ± 133.9 pA/pF at -100 mV (n = 5); Wild-type TRPV3: 615.0 ± 266.7 pA/pF at +100 mV, -471.0 ± 83.2 pA/pF at -100 mV, n = 9） (Fig. S4 A and B). この結果は、TRPV3のTRPボックスの696位のアルギニンをリジンに置換すると、カルシウム依存的に2-APB刺激でチャネルを脱感作状態にするが、樟脳刺激では脱感作状態にならないことを示唆するものであった。 ポアループドメインのカルシウム結合残基であるアスパラギン酸641は、すべてのTRPVチャンネルで保存されており、TRPチャネルの透過特性に重要である (26, 27)。 D641をアスパラギン（N）に変異させると、TRPV3や他のTRPチャネルのルテニウムレッドブロックや高親和性エクストラセルラーカルシウム阻害が減少することが示されている（17, 22, 26, 27）。 そこで、D641N変異がTRPV3-R696Kクローンのカルシウム依存的な2-APB応答の喪失を緩和するかどうかを検討した。 FLIPRアッセイにおいて、TRPV3-D641NのEC50は2.8 ± 1.3 μM (nHill = 0.7) であり、野生型TRPV3 (5.7 ± 1.2 μM, nHill = 1.1) の約半分の値であることが確認された。 二重変異体 TRVP3-D641N/R696K の EC50 は 3.3 ± 1.1 μM (nHill = 1.1) であり、D641N 変異は TRPV3-R696K の 2-APB 応答を完全に回復させたことが示された。 予想通り、TRPV3、TRPV3-R696K、TRPV3-D641N、TRPV3-D641N/R696Kの間でカンファー応答は類似していた（図S4 CおよびD）。 これらの研究は、TRPV3-R696が純粋に2-APB変異でないことを実証している。 7291>

TRPV3オルソログにおける2-APB感受性

アミノ酸の保存とオルソログ間の変異は、TRPチャネルを含むタンパク質の構造-機能関係を解剖するための有用なツールである (28, 29). そこで、これらのTRPV3オルソログが樟脳や2-APBに対して同等の反応を示すかどうかを検討した。 実際、マウスと同等の426位にヒスチジンを持つヒト、イヌ、カエルのTRPV3チャネルは、HEK293細胞で過剰発現させると、同様の2-APB応答を示した（ただし、Xenopus tropicalis TRPV3のカンファー応答は野生型マウスTRPV3に比べて低下していた）（Fig. 2C ）。 予想通り、ヒト、イヌ、カエルのH426をNに変異させると、これらのTRPV3オルソログのそれぞれで2-APB濃度応答曲線は強く右側にシフトした（図2B）。 ここでも、この変異は野生型TRPV3オルソログと比較して、カンファー感度を低下させることはなかった（図2C）。 逆に、ヒトおよびカエルのTRPV3 H426N変異体は、いずれも野生型と比較してわずかにカンフル剤感受性が高いことが確認された。 これらの結果は、TRPV3の2-APB活性化機構が異なる生物種間で保存されている可能性を示している

The 2-APB Sensitivity in Related ThermoTRPs: TRPV1, TRPV2, TRPV4.

哺乳類のTRPV3はTRPV1（アミノ酸相同性39％）、TRPV2（同36％）、TRPV4（同38％）と近縁であり、TRPV3はTRPV1（同38％）、TRPV2、TRPV4（同38％）と近縁です。 興味深いことに、2-APBはTRPV1、TRPV2、TRPV3に共通のアゴニストであり、TRPV4には作用しない(18)。 そこで、これらの関連するイオンチャネルに対する2-APBの作用に共通のメカニズムが存在するかどうかを検討した。 マウスTRPV3のHis-426に相当する位置は、TRPV1 (N419), TRPV2 (N379), TRPV4 (N456) ではNである（図4A；図S5A）。 また、TRPボックス内のマウスTRPV3のR696に相当する位置は、TRPV1ではR（R701）、TRPV2では保存されたリジン（K664）、TRPV4では非荷電トリプトファン（W737）である（図4A；図S5A）＜7291＞＜4535＞図4.TRPV1, TRPV2, TRPV4, TRPV3, TRPV4, TRPV3, RTV3, TRPV3, TRPV3, TRPV4, TRPV3, TRPV3, TRPV3, TRPV4

同定された2つの細胞質残基におけるTRPV4の変異は、TRPV4を2-APBに感受性にする。 (A) マウスTRPV3とラットTRPV4のN末端領域とC末端TRPボックスの配列アライメント。 2-APBに対するマウスTRPV3の反応に必要な残基とTRPV4における同等の残基を示した。 図は2つの細胞内残基の位置を示し、TRPV4における二重変異の模式図を示す。 エラーバーはSEであり、各クローンについてn = 5である。 (B)野生型または変異型TRPV4をトランスフェクトしたHEK293細胞における2-APBおよび4-α-PDDに対する濃度依存的応答；各クローンについてn = 5。

我々は、哺乳類および両生類のTRPV3が適切な2-APB応答に特に必要であり、この残基のN-H変異が鶏TRPV3の強力な2-APB応答を誘発するのに十分であるというN末端のH残基に注目した。 野生型のTRPV1とTRPV2は、TRPV3のH426と同等の位置にNを持つが、2-APBに対して強固な応答を示す。 この結果は、TRPV1とTRPV2がTRPV3とは異なるメカニズムで2-APBに応答している可能性を示唆している。 そこで、この位置にHを導入することで、TRPV2およびTRPV1の2-APB応答に特異的に影響を与えるかどうかを検証した。 TRPV1-N419H変異体は、2-APBとカプサイシンの両方に対して応答が増強されており、チャネルの発現や機能に対する非特異的な影響を示していた（図S5B）。 また、TRPV2-N379H変異体は、2-APBとプロベネシド（別のTRPV2アゴニスト）に対して、野生型TRPV2と同様の応答を示した（図S5C）（30）。 この結果は、TRPV2やTRPV1の2-APB活性化機構がTRPV3のそれと完全に保存されていないことを示唆している（考察参照）

次に、TRPV4で2-APB応答がないのは、TRPV3のH426とR696の同等残基が原因かどうかを検討した。 この疑問を解決するために、TRPV4のN456とW737の相当するアミノ酸残基をそれぞれHとRに変異させた（図4A）。 野生型TRPV4とTRPV4-W737Rは、ベクター導入したコントロールと比較して、わずかな2-APB反応しか示さなかった（図4B）。 しかし、TRPV4-N456HをトランスフェクトしたHEK293細胞は、131.0 ± 3.3 μM (nHill = 2.4) のEC50で2-APBに応答することが分かった。 また、二重変異N456H/W737Rを有するTRPV4は、2-APBに対してさらに強固な応答を示し、EC50は10.0 ± 0.8 μM（nHill=1.2）であった（野生型マウスTRPV3の値に近い）（図4B）。 TRPV4アゴニスト4-α-PDに対する応答は、野生型TRPV4とすべてのTRPV4変異体の間で有意差はなく、2-APB応答の増加は、TRPV4発現レベルの増加または全体的な機能の獲得に起因しないことが示唆された（図4B）。 TRPV4、TRPV4-N456H、TRPV4-W737R、TRPV4-N456H/W737Rを発現する摘出インサイドアウトパッチでの記録では、150 μM 2-APBによる単一チャネル活性がTRPV4-N456HとTRPV4-N456H/W737Rで共に見られ、後者はより強固な応答を示した（図S6 BとC）。 野生型TRPV4およびTRPV4-W737Rでは、2-APBによる単一チャネル活性は見られなかった（図S6A；およびデータは示していない）。 これらの結果から、TRPV4.

の2-APB感受性がない原因は、今回のスクリーニングで同定された2つのアミノ酸残基の違いであることが明らかとなった。