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July 2000

Toxicological Principles for Safety Assessment of Food IngredientsRedbook 2000Chapter IV.C.1.d. Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test

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このガイダンスは、このトピックに関する食品医薬品局（FDA）の現在の考えを表したものです。 これは、いかなる人に対しても、いかなる権利も創出または付与するものではなく、FDAまたは一般大衆を拘束するために作用するものでもない。 代替アプローチが適用される法規制の要件を満たす場合、そのアプローチを使用することができます。 代替アプローチについて議論したい場合は、このガイダンスの実施を担当するFDAスタッフに連絡してください。 適切なFDAスタッフを特定できない場合は、本ガイダンスのタイトルページに記載されている適切な番号に電話をしてください

I. はじめに

小核は、染色体の偏心断片または染色体が分裂期に遅れ、細胞分裂時に娘細胞の核に組み込まれないときに形成される細胞質クロマチン含有体である。 染色体切断、染色体構造異常、紡錘体異常などの遺伝的損傷は小核の形成につながるため、小核の発生率はこれらの損傷の指標となる。 二本鎖染色体切断を引き起こす薬剤（クラストゲン）は、基本的にすべて小核を誘発することが確立されている。 小核の測定は、染色体異常のスコアリングよりもはるかに速く、技術的な負担も少ないため、また、小核は2種類の重要な遺伝子損傷（クラスタ形成と紡錘体破壊）から生じるため、小核測定法は、これらの損傷を引き起こす化学物質のスクリーニングに広く使用されています

このガイダンスでは、最も広く用いられているin vivo小核測定法（哺乳類赤血球小核測定法）を取り上げます。 このin vivo小核試験は、動物（通常はげっ歯類）の骨髄や末梢血から採取した赤血球を分析し、被験物質による赤芽球の染色体や分裂装置への障害を検出するために使用されます。

小核試験の目的は、染色体の断片や全染色体を含む小核の形成をもたらす細胞遺伝学的損傷を引き起こす物質を同定することである。 このような細胞では、主核がないため、特異的な染色法を用いることで微小核の可視化が容易になる。 治療した動物で小核化した多色性赤血球の頻度が増加した場合、染色体損傷が誘発されたことを示している

II. 定義

セントロメア（動原体）とは、細胞分裂の際に紡錘繊維が結合し、娘染色体を娘細胞の極に秩序正しく移動させる染色体の領域のことです。

正常赤血球は、リボソームを持たない成熟した赤血球で、リボソームを選択的に染色することにより、未熟な多色性赤血球と区別することができる。

多色性赤血球は、発育の中間段階にある未成熟な赤血球で、まだリボソームを含んでいるので、リボソームを選択的に染色することによって成熟した正常赤血球と区別することができる。 初期検討事項

ネズミの骨髄は多色性赤血球が産生される組織であるため、この検査では日常的に使用されます。 末梢血中の小核化した未熟な（多色性の）赤血球の測定は、脾臓が小核化した赤血球を除去できないことが証明されている種、あるいは構造的および／または数値的な染色体異常を引き起こす薬剤を検出するのに十分な感度を示している種で同様に行うことができます。 小核は、いくつかの基準によって区別することができる。 これらの基準には、小核中の動原体または動原体DNAの有無の同定が含まれる。 小核化した未熟な（多色性の）赤血球の頻度が主要なエンドポイントである。 末梢血中の所定の数の成熟赤血球のうち、小核を含む成熟（正常色）赤血球の数も、動物を検討中の種における赤血球の寿命を超える期間（例えば、マウスでは4週間）連続処理する場合に、その種／系統において小核化赤血球に対する有意な脾臓選択が生じないという条件で、アッセイのエンドポイントとして使用することが可能である。 4074>

この哺乳類in vivo小核試験は、種間、組織間、遺伝的エンドポイント間で異なるかもしれないが、in vivo代謝、薬物動態、DNA修復過程の要因を考慮できる点で変異原性有害性の評価に特に適している。 in vivo試験は、in vitroシステムで検出された変異原性影響のさらなる調査にも有用です。

被験物質や反応性代謝物が標的組織に到達しないという証拠がある場合、この試験の使用は適切ではありません。

IV. 試験法の原理

動物は適切な経路で試験物質に曝露されます。 骨髄を用いる場合は、投与後適当な時期に動物を犠牲にし、骨髄を採取して標本化し、染色する。(16),(17),(18),(26),(32),(41) 末梢血を用いる場合は、処理後の適当な時期に採血し、塗抹標本にし、染色する。 (4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) 標本は微核の存在を分析する。 方法の説明

A. 調製品

1. 動物種の選択

歴史的に、マウスまたはラットがこのアッセイに日常的に使用されてきた。 骨髄が採取された組織である場合、適切な哺乳類種を使用することができます（上記III.項参照）。 他の毒性試験と同様、適切な種を選択することは正当化されるべきである。 末梢血を使用する場合は、マウスを推奨する。 しかし、脾臓が小核化した赤血球を除去しない種、または構造的および／または数的な染色体異常を引き起こす薬剤を検出するのに十分な感度を示した種であれば、適切な哺乳類種を使用することができる。 健康な若い動物の一般的な実験系統を採用すること。 試験開始時、動物の体重の変動は最小限にとどめ、各性の平均体重の±20％を超えないこと

2. 住居および摂食条件

実験動物室の温度は、使用する種にとって適切でなければならない。 相対湿度は30%以上、清掃時以外は70%を超えないことが望ましいが、50～60%を目安にする。 照明は人工照明を使用し、12時間明、12時間暗の順序で点灯させる。 給餌は、通常の実験用飼料を使用し、飲料水は無制限に供給することができる。 餌の選択は、この経路で投与する場合の被験物質の適切な混和を確保する必要性に影響されるかもしれない。 3.動物の準備

健康な若齢成熟動物を対照群と治療群に無作為に割り当てるものとする。 動物は一意に同定される必要がある。 動物は少なくとも5日間、実験室の環境に慣らす必要がある。 ケージの配置による影響を最小限にするため、ケージの配置を工夫する。 液体試験物質は、直接投与するか、投与前に希釈することができる。 安定性データにより保存が許容されることが示されない限り、被験物質の新鮮な製剤を使用すべきである

B. 試験条件

1. 溶媒/ビヒクル

溶媒/ビヒクルは、使用する用量で毒性作用がなく、被験物質との化学反応が疑われないものでなければならない。 一般的に使用されている溶剤/ビヒクル以外を使用する場合は、被験物質や動物との適合性を示す参考データでサポートする必要があります。 2.対照群

ネズミを用いた試験において、一般的に陽性及び陰性（溶媒/ビヒクル）対照を各性で同時に含める必要があります。 ただし、GLPガイドラインに基づく一般毒性試験の一環として小核試験を実施する場合は、化学分析により適切な投与量の検証を行うことになります。 このような場合、陽性対照薬による動物の同時処理は必要ない場合があり、今回の実験に含まれない動物から以前に得られた適切な参照試料を含めることによって、染色およびスコアリング手順の制御を行うことができる。 霊長類やイヌのような高等種の実験では、使用する種の陽性対照物質に対する反応が試験所 で事前に証明されていれば、陽性対照物質を省略することができる。 すべての場合において、同時に行う陰性対照は必須の試験要素である。 試験物質による治療を除き、対照群の動物は治療群の動物と同一の方法で取り扱われるべきである。

陽性対照物質は、バックグラウンドよりも検出可能で統計的に有意な増加をもたらすと予想される曝露レベルで、生体内に小核を生成する必要がある。 陽性対照の用量は、その効果が明らかであるが、コード化されたスライドの同一性を読者に直ちに明らかにしないように選択されなければならない。 陽性対照は被験物質とは異なる経路で投与し、一度だけサンプリングすることは容認される。 さらに、入手可能であれば、化学的分類に関連した陽性対照物質の使用も考慮され得る。 陽性対照物質の例としては、以下のものが挙げられる。

Chemical CAS Number
Ethyl methanesulphonate 62->Ethyl methanesulphonate50-0
エチルニトロソウレア 759-73-9
Mitomycin C 50-…07-7
シクロホスファミド（一水和物） 50-18-0 (6055-19-2)
トリエチレンメラミン 51-18-3

陰性対照の動物。 ただし、適切な状況下では、処理前と処理後の試料を比較することにより、ある動物をそれ自身の対照として使用することが可能な場合がある。 陰性対照に単一サンプリングを適用する場合、選択したサンプリング時刻は正当化される べきである。 さらに、(a)試験機関から入手可能なデータ、または(b)選択した溶媒／車両によって劇症または変異原性影響が誘発されないことを実証する過去または公表済みの対照データがない限り、未処理の対照も使用すべきである。

末梢血を使用する場合、処理前の試料も同時陰性対照として認められる場合があるが、短期末梢血試験（例, 1-3回の処理）において、得られるデータが過去のコントロールの予想範囲内であり、溶媒の影響がないことが実証された場合にのみ許容されます。 ラットおよびマウスの手順

以下のセクションでは、このアッセイで最もよく使用される種であるマウスおよびラットの手順に関するガイダンスを提供します

A. 動物の数と性別

各処理群及び対照群は、性別ごとに少なくとも5匹の分析可能な動物を含むべきである。 (12) 試験時に、同じ種で同じ曝露経路を用いた試験から得られるデータがあり、毒性に性別間の実質的差がないことが実証されている場合、単一性別での試験で十分である。

B． 治療スケジュール

いくつかの異なる治療スケジュール（すなわち、24時間間隔で1、2、またはそれ以上の治療）が推奨され得る。 この試験で肯定的な効果が実証されている限り、あるいは否定的な試験の場合、毒性が実証されているか、限界用量（下記「D」項参照）を使用し、サンプリングの時点まで投与を継続する限り、延長投与レジメンからのサンプルは許容されます。 これは、マウスとラットの亜慢性までの反復暴露により、従来の急性試験法で得られたものと同程度の大きさの影響が生じたという研究に基づいている。(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) しかしながら、長期試験では真のMTDを達成できないために感度が低下する可能性や適応が起こる可能性が懸念されるので、現在はより長期間処理する場合に測定法の感度が確認されるまで、処理期間は4週間に限定すべきと考えられています。(12)

被験物質はまた、分割投与、すなわち、, 大量投与を容易にするため、あるいは被験物質の血中濃度の変動を最小にするため、数時間以内の間隔で同日に2回以上の処理を行うこともできる。 骨髄のサンプルは、最後の投与後24時間から48時間の間に少なくとも2回、サンプル間の適切な間隔をあけて採取される。 投与後 24 時間より早い時期の採 取は、正当な理由がなければならない。 末梢血のサンプルは、最後の治療後 36 時間から 72 時間の間に少なくとも 2 回、適切な間隔を置 いて採取される。 1 回の採血で陽性と判定された場合、追加採血は不要である。

  • 1日3回以上の治療が行われる場合（例えば、24時間間隔で3回以上の治療）、骨髄については最終治療後24時間以内に、末梢血については最終治療後40時間以内に1回採取してもよい。 (12), (20)

    • 適切かつ科学的に正当であれば追加の採取時間を使用してよい。

    C. 投与量レベル

    入手可能な適切なデータがないため投与量範囲探索試験を実施する場合、主試験で使用するのと同じ種、株、性及び治療レジメンを用いて同じ実験室で実施すべきである。 (7) 毒性がある場合、最初のサンプリング時間には3段階の線量レベルを使用すべきである。 これらの用量レベルは，明らかな毒性からほとんど毒性がないまでの範囲をカバーする必要がある。 後のサンプリング時には、最高用量のみを使用する必要がある。 最高用量とは、同じ投与法に基づいて、より高い用量レベルでは致死が予想されるような毒性の徴候を示す用量と定義される。 低用量の無毒性で特異的な生物学的活性を有する物質（ホルモンやマイトジェンなど）は、用量設定基準の例外となる場合があり、ケースバイケースで評価する必要がある。 最高用量はまた、骨髄の毒性の何らかの徴候（例えば、骨髄または末梢血中の全赤血球のうち未熟赤血球の割合の減少）を生じる用量と定義することもできる。

    D. 限界試験

    少なくとも2000mg/kg体重の1つの用量レベルでの単回処理、または同日の2回の処理で観察可能な毒性影響がなく、構造的な関連物質からのデータに基づいて遺伝毒性が期待できない場合、3用量レベルでの完全な試験は必要ない場合があります。 より長期の試験については、14 日までの投与では 2000 mg/kg/ 体重/日、14 日を超える投与では 1000 mg/kg/ 体重/日を限度量とする。 ヒトへの曝露が予想される場合、限界試験で使用する用量レベルを高くする必要があることを示す場合がある。

    E. 投与方法

    被験物質は通常、胃管または適切な挿管カニューレを用いた経口投与、または腹腔内注射により投与されます。 正当化できる場合は、他の曝露経路も許容される。 一度に経口または注射で投与できる最大液量は、試験動物の大きさによって異なる。 その量は体重 100g あたり 2ml を超えてはならない。 これ以上の量を使用する場合は、正当な理由が必要である。 通常、高濃度になるほど影響が悪化する刺激性又は腐食性の物質を除き、試験量の変動は、すべての用量レベルで一定の量を確保するように濃度を調整することにより、最小限に抑えるべきである

    F. 骨髄/血液の調製

    骨髄細胞は通常、犠牲となった直後の大腿骨または脛骨から採取する。 通常、大腿骨または脛骨から細胞を取り出し、確立された方法を用いて調製し、染色する。 末梢血は尾静脈やその他の適切な血管から採取する。 血球は直ちにsupravitally(4),(5),(14)で染色するか、塗抹標本にしてから染色する。 DNA特異的染色剤（例えば、アクリジンオレンジ(15)やヘキスト33258とピロニン-Y(30)）を使用すると、非DNA特異的染色剤の使用に伴うアーチファクトをある程度除去することが可能である。 この利点は、従来の染色（例えば、ギムザ）の使用を排除するものではない。 追加のシステム（例． セルロースカラムによる有核細胞の除去(36))も、これらのシステムが実験室での小核調製に十分に機能することが示されているのであれば、用いることができる。 分析

    全赤血球（未熟＋成熟）中の未熟赤血球の割合は、各動物について、骨髄については少なくとも200個、末梢血については1000個の赤血球の合計を数えることにより決定する。 9）陽性および陰性対照を含むすべてのスライドは、顕微鏡分析の前に独立してコード化する必要がある。 小核化した未成熟赤血球の発生率については、1匹あたり少なくとも2000個の未成熟赤血球をスコア化する。 成熟赤血球の小核をスコアリングすることにより、さらなる情報を得ることができる。 スライドを分析する場合、全赤血球中の未熟赤血球の割合が対照値の20％未満であってはならない。 4週間以上連続投与する場合は、1匹あたり少なくとも2000個の成熟赤血球を小核の発生率としてスコア化することも可能である。 自動分析システム（細胞懸濁液の画像分析またはフローサイトメトリー分析）は、従来の顕微鏡によるスコアリングと比較して適切に正当化され検証されていれば、手動評価の代替とすることができる（12）

    VII. ラット及びマウス以外の種に対する手順

    マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌ、非ヒト霊長類、及びヒトにおける研究に基づく公表情報(3)(6)(18)(28)(31)(32)(39)(40).を参照。(45)は、小核化赤血球の自然発生および誘発頻度はほとんどの哺乳類種で同様であることを示し、骨髄中の小核化未熟赤血球の発生率の測定は、これまでに研究されたこれらの種における染色体または紡錘体の損傷を評価するために適切であることを示唆しています。 骨髄における小核化した赤血球の出現と消失は、それぞれの種における赤血球形成の動態と赤血球の寿命の関数であり、したがって投与とサンプリングのレジメンは、それぞれの種の赤血球動態の適切なパラメータに従って変更する必要がある。 マウス、ラット以外の種も適宜使用可能であるが、以下の情報を記載すること。

    • 選択した種の正当性、ならびに使用した種における赤血球造血の動態および赤血球の寿命に関連して使用した投与およびサンプリングスケジュール
    • 自発小核の頻度が公表情報と一致していること、および／または試験を実施している研究所内で一致していることの証拠。
    • 既知の遺伝毒性物質が使用する種で小核頻度の増加をもたらす証拠、および誘発された反応の大きさの参考値;
    • 末梢血からの小核細胞の脾臓選択的除去の影響（後者がモニターする組織として機能する場合）;
    • 脾臓選択的除去の影響

    viii. データおよび報告

    A. 治療結果

    動物個体データは表形式で提示されるべきである。 実験単位は動物である。 スコアされた未熟赤血球の数、小核化した未熟赤血球の数、全赤血球中の未熟赤血球の数は、分析した各動物について別々に記載されるべきである。 4 週間以上連続投与する場合、成熟赤血球のデータを収集している場合は、そのデータも記載する。 全赤血球中の未熟赤血球の割合、および該当する場合は小核化した成熟赤血球の割合を各動物について記載すること。 雌雄間の反応に差があることを示す証拠がない場合、雌雄のデータを組み合わせて統計解析することができる

    B. 結果の評価と解釈

    小核細胞数の用量依存的な増加、あるいは単一サンプリング時間における単一用量群での小核細胞数の明確な増加など、陽性結果を判定するためのいくつかの基準がある。 試験結果の評価には統計的手法を用いるべきである(24),(35) 。陽性、陰性、あるいは不明瞭な結果の統計的基準は、プロトコルに明確に記載されるべきである。 生物学的要因は解釈を変える可能性があるため、統計的有意性が結論に達するための唯一の決定 要因であってはならない。 4074>

    ほとんどの実験が明らかに陽性または陰性の結果を出すが、まれに被験物質の活性について明確な判断を下せないデータセットがある。

    小核試験で陽性の結果は、物質が小核を誘発することを示し、それは試験種の赤芽球における染色体損傷または有糸分裂装置の損傷の結果である。 陰性は、試験条件下において、被験物質が被験種の未成熟赤血球において小核の形成につながる染色体又は紡錘体の損傷を生じないことを示す。

    被験物質又はその代謝物が一般循環又は特に標的組織に到達する可能性（例えば、全身毒性）を議論する必要がある。 1つ以上の他の試験系で遺伝毒性の陽性証拠がある場合、小核陰性試験における十分な標的組織への曝露の実証は特に重要な検討事項である

    C. 試験報告書

    試験報告書には、以下の情報も含める必要があります：

    1. 試験物質
    • 識別データおよびCAS番号,
    • 物理的性質および純度
    • 試験の実施に関連する物理化学的特性
    • 試験物質の安定性（もし分かっていれば）
    2. 溶媒/ビヒクル
    • ビヒクルの選択の正当性
    • 溶媒/ビヒクル中の被験物質の溶解性及び安定性（既知の場合）
    3. 投与液
    • 投与液の調製及び使用時期（又は調製と使用の間隔）、保存条件
    • 投与液の濃度を確認できるデータがある場合
    4. 試験動物
    • 使用した種/系統、正当な理由
    • 動物の数、年齢、性別
    • 供給元、飼育条件、食事など
      • 使用した種/系統、正当な理由
        • 使用した種/系統、正当な理由

          • …

    • 試験開始時の動物の体重、体重範囲、各グループの平均値および標準偏差
    • 該当する場合、末梢血中の小核細胞の発生率に対する脾臓選択の潜在的影響に関する情報
    5.試験開始時の動物の個体数、体重、体重範囲、標準偏差、脾臓の選択、小核発生率に関する情報 試験条件
    • 陽性および陰性（車両/溶剤）対照データ
    • 範囲設定試験によるデータ。 実施された場合
    • 用量レベルの選択の根拠
    • 被験物質の調製の詳細
    • 被験物質の投与の詳細
    • 投与経路および投与レジメンの根拠
    • 被験物質が一般循環または標的組織に達したことを確認するための方法。 該当する場合
    • 食事／飲料水試験物質濃度（ppm）から実際の投与量（mg/kg体重/日）への換算値。 3412>
    • 食品および水質の詳細
    • 処理およびサンプリングスケジュールの詳細
    • スライド作成方法
    • 毒性の測定方法
    • 小核発生未熟児赤血球のスコアリング基準および。 また、適切な場合には、成熟赤血球
    • 動物あたりの分析細胞数
    • 試験を陽性、陰性、または不明確とみなす基準
    6. Results
    • sign of toxicity
    • proportion of immature erythrocytes among total erythrocytes
    • number of micronucleated immature erythrocytes among total immature erythrocytes, given separately for each animal
    • if appropriate and applicable, number of micronucleated mature erythrocytes among total mature erythrocytes.If the respective events, only defined in the respective animal
    • Mean ± standard deviation of micronucleated immature and if applicable, mature redthrocytes per group
    • dose-response relationship, if possible
    • statistical analyses and justification for method applied, with appropriate literature citation
    • concurrent and historical negative control data
    • current and historical positive control data
    7.The Hard Response: The Hard Responseは、動物毎に個別に与えられる
  • 小球の標準偏差、および可能であれば、適用した方法の正当性を示す。 結果の考察
    8. 結論

    XI. 補遺：先天性断片と動原体染色体に由来する小核の同定

    小核は、有糸分裂で遅れた先天性断片または染色体全体によって形成されることがある。 後者の微小核は、その大きなサイズから、C-バンディング(47)やDNA量の測定によって初めて認識された(46)。 しかし、これらの方法はあまり信頼できるものではなかった。 そこで、微小核中のセントロメアの存在を確認し、それによって胞胚由来と無胚葉由来の微小核を区別するために、2つの分子細胞遺伝学的方法が開発された：(12) 1) 免疫蛍光CREST染色と 2) 膵島DNAプローブを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）である。

    骨髄小核試験に適用されるCREST法はMillerとAdlerによって詳しく述べられている(33)。スライド上の細胞（正常骨髄塗抹）を固定、脱水し、SDSとTriton-Xで2段階インキュベートし、抗体で染色した後、染色液で染色する。 DNAはHoechst 33258で対比染色する。

    FISHでは、セントロメアの近くでハイブリダイズするminor satellite DNA-probeを用い、セントロメア領域があればその同定を行う(43)。 この方法は、フローソートされた小核含有赤血球(10)、あるいは末梢血試料から得られた単離小核に適用できる。(13)

    コントロールスライドでは、centromeric regionを含む標識微小核の割合は約50%(43) 既知のアニューゲン（コルヒチン、ビンブラスチン）により誘導される微小核の約70%が標識されているが(33) クラストジェン（ハイドロキノン、マイトマイシンC）により誘導されるものは5〜15%の標識微小核のみを示している。(33)ある化学物質の相対的な核形成活性と無核活性を特徴づけるには、遠位核領域を含む多色性赤血球1000個当たりの小核化した多色性赤血球の数を指標とするとよい。 (42)

    これまでに述べたFISH法の最大の欠点は正常色と多色性赤血球を区別しない点であった。(12） したがって、存在する小核の大部分が試験品によって誘発される調製品のみが分析に適する。 例えば、成獣の急性被曝実験からの末梢血試料は、標的細胞集団（未成熟赤血球）が試料中の赤血球の3～5％しかないため、本質的に分析に適さない。

    結論として、CREST-あるいはFISH-標識は、適切な試料を分析に用いることに注意を払えば、in vivo小核アッセイにおける化学物質の異性化特性を検出する信頼できる方法と考えられる（12）。 しかし、現在の方法は複雑で、その使用は、化学物質による紡錘体障害の疑いがある場合（例えば、。 しかし、現在の方法は複雑なため、化学物質による紡錘体の障害（大きな小核の存在、倍数性の誘発など）が疑われる場合、あるいはこの機構的情報を得るための特別な理由がある場合にしか使用できない。 参考文献

    1. Armstrong, M.J., Galloway, S.M. (1993). 2-アセチルアミノフルオレンまたはベンゼンを慢性的に経口投与することにより、mu-PIM-1トランスジェニックマウスの末梢血に小核を誘発するが、ジエチルニトロサミンまたは1,2-ジクロロエタンでは誘発されない。 Mutation Res. 302:61-70.
    2. Choy, W.N., MacGregor, J.T., Shelby, M.D., Maronpot, R.R. (1985)（2011）. B6C3F1マウスにおけるベンゼンによる小核の誘発。 NTP 発癌性バイオアッセイにおける末梢血塗抹標本のレトロスペクティブな解析。 Mutation Res. 143:55-59.
    3. Choy, W.N., Willhite, C.C., Cukierski, M.J. and Book, S.A. (1989). L-セレノメチオニンの霊長類小核試験。 Environ. Molec. Mutagenesis 14:123-125.
    4. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). マウス末梢血赤血球を用いたアクリジン・オレンジ・スプラビタル染色による小核試験。 CSGMT/JEMS.MMSによる第5回共同研究の総括報告書。 Mutation Res. 278:83-98.
    5. 小核試験共同研究会（CSGMT/JEMMS.MMS、日本環境変異原学会哺乳類変異原性研究会）（1995）.小核試験共同研究会（CSGMT/JEMMS.MMS、日本環境変異原学会哺乳類変異原性研究会）（1995）. マウス短時間末梢血小核試験推奨プロトコール. Mutagenesis 10:153-159.
    6. Everson, R.B., Wehr, C.M., Erexson, G.L. and MacGregor, J.T. (1988)（2013）. Marginal Folate Depletion with Increased Human Chromosomal Damage In Vivo: Demonstration by Analysis of Micronucleated Erythrocytes（限界葉酸欠乏とヒト染色体損傷増加の関連性：微小核形成赤血球の分析による実証）。 Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J., and Richold, M. (1992). 英国毒性学会／英国環境変異原学会作業部会報告書。 In Vivo 変異原性試験における投与量設定(Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays). Mutagenesis 7:313-319.
    7. Garriott M.L., Brunny J.D., Kindig D.E., Parton J.W., Schwier L.S. (1995). In Vivo Rat Micronucleus Test: 14-Day Studyとの統合。 Mutation Res. 342:71-6.
    8. Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). 骨髄小核試験における多色性赤血球と正常赤血球の比率を推定するためのサンプルサイズ。 Mutation Res. 347:97-99).
    9. Grawé J., Nüsse M. and Adler I.-D. (1997). フローサイトメトリーによるマウス赤血球の小核誘発の定量的および定性的研究。 I. 既知および遺伝毒性が疑われる化学物質による末梢血多色性赤血球の小核誘導の測定(Peripheral Blood Polychromatic Erythrocytes in Measurement of Micronucleus Induction by Chemicals with Known and Suspected Genotoxicity). Mutagenesis 12:1-8.
    10. Hamada, S., Sutou, S., Morita, T., Wakata, A., Asanami, S., Hosoya, S., Ozawa, S., Kondo, K., Nakajima, M., Shimada, H., Osawa, K., Kondo, Y, 浅野直樹・佐藤聡一・田村秀樹・矢島直樹・Marshall, R., Moore, C., Blakey, D.H., Weaver, J.L., Torus, D.K., Proudlock, R., Ito, S., Namiki, C., Hayashi, M. (1999)． Rodent Long-Term Micronucleus Assay の評価。 CSGMT/JEMS.MMS による第 13 回共同研究の概要, Environ. Molec. Mutagenesis 37(2):93-110.
    11. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Gatehouse, D.G., Adler, I.-D., Blakey, D.H., Dertinger, S.D., Krishna, G., Morita, T., Russo, A. and Sutou,S. (2000). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay（生体内げっ歯類小核アッセイ）。 II. 反復処理、毒性試験との統合、自動スコアリングを含むプロトコル設計のいくつかの側面。 Environ. Molec. Mutagenesis 35: 234-252.
    12. 林正樹・マキパアッカネン・田辺裕之・本間正樹・鈴木崇之・松岡明彦・水沢秀樹・祖父江哲郎 (1994). マウス血液からの微小核の分離、マウス染色体DNAプローブを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション. Mutation Res. 307:245-251.
    13. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1990). アクリジンオレンジコートスライドを用いたマウス末梢血網状赤血球による小核測定法。 Mutation Research 245:245-249.
    14. 林 昌彦・曽布見俊彦・石立正人(1983). アクリジンオレンジ蛍光染色の微小核試験への応用． Mutation Res. 120:241-247.
    15. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay（生体内げっ歯類小核アッセイ）。 Mutation Res. 312:293-304.
    16. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res. 18:187-190.
    17. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. および Newell, G.W. (1983). 遺伝毒性の尺度としての小核の誘発。 Mutation Res. 123:61-118.
    18. Henderson, L., Fedyk, J., Windebank, S., Smith, M. (1993). アザチオプリンによる急性および亜慢性処理後のラット骨髄および末梢血における小核の誘発。 Mutation Res. 291:79-85.
    19. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). マウス末梢血小核試験における二重投与後30±6時間の最適で一般的なサンプリング時間。 Mutagenesis 10:313-319.
    20. Jauhar, P.P., Henika, P.R., MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Shelby, M.D., Murphy, S.A., Margolin, B.H. (1988). 1,3-ブタジエン。 13 週間吸入曝露した B6C3F1 マウスの末梢血における小核化赤血球の誘発。 Mutation Res. 209:171-176.
    21. Krishna, G., Criswell, K., Zielinski, D., Urda G., Junau, P., Bleavins, M., Theiss, J., (1998a)（1999 年）。 5 種類のモデル化合物を用いたフローサイトメトリーによるラットの小核評価の妥当性検証。 Environ. Molec. Mutagen. 31:46.
    22. Krishna, G., Urda, G., Theiss, J. (1998b). 遺伝毒性評価をルーチンの毒性学研究に統合する原則と実践。 製薬業界の視点(A Pharmaceutical Industry Perspective). Environ. Molec. Mutagen. 32:115-120.
    23. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989)（2019）. In Vivo 細胞遺伝学的アッセイの統計的分析 In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Luke, C.A., Tice, R.R., Drew, R.T. (1988). マウスのベンゼン誘発骨髄損傷に及ぼす暴露レジメンと暴露期間の影響。 DBA/2 マウスにおける性差の比較。 Mutation Res. 203:251-271.
    24. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ramel C., Salamone, M.F., Tice, R.R. and Wild, D. (1987). 哺乳類骨髄赤血球における小核アッセイ実施のためのガイドライン。 Mutation Res. 189:103-112.
    25. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M. (1983年). 循環赤血球中の小核。 マウスのルーチン毒性試験における染色体損傷の迅速なスクリーニング（原題：A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice）。 「毒性学の科学と実践の発展”, Ed. このような場合，”Development in Science and Practice Toxicology”, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp.555-558.
    26. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Gould, D.H. (1980). Clastogen-Induced Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes（末梢血赤血球におけるクラストーゲン誘発小核）。 改善された小核試験の基礎。 Environ. Mutagenesis 2:509-514.
    27. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). In Vivo Erythrocyte Micronucleus Test（生体内赤血球小核試験）。 定常状態での測定により、アッセイ効率が向上し、毒性試験との統合が可能になる。 Fund. Appl. Toxicol. 14:513-522.
    28. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., and Langlois, R.G. (1983). このような場合，”Mutation Res. 120:269-275.
    29. Matter, B.E. and Schmid, W. (1971). 6種の哺乳類の骨髄細胞におけるトレニモン誘発染色体損傷。 Mutation Res. 12:417-425.
    30. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990). 哺乳類骨髄および末梢血における生体内小核測定法（The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood）。 A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program（米国環境保護庁遺伝子毒性プログラムの報告書）。 Mutation Res. 239:29-80.
    31. Miller B.M. and Adler I.-D. (1990). In Vivoで誘発された赤血球の小核に対する抗動脈小体抗体染色（CREST染色）の適用． Mutagenesis 5:411-415.
    32. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. (1986). 定量的高感度蛍光ハイブリダイゼーションによる細胞遺伝学的解析． Proc. Natl.Acad. Sci. USA 83:2934-2938.
    33. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990).（英語）。 In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures （D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures）。 変異原性試験のガイドラインに関する UKEMS 小委員会． 報告書。 第 1 部改訂版。 ケンブリッジ大学出版局、ケンブリッジ、ニューヨーク、ポートチェスター、メルボルン、シドニー、115-141頁.
    34. Romagna, F. and Staniforth , C.D.(1989). 自動化された骨髄小核試験。 Mutation Res. 213:91-104
    35. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1982).自動骨髄小核試験(Automated Bone Marrow Micronucleus Test). マウスにおける累積的染色体障害の迅速なスクリーニング。 循環微小核形成赤血球の蓄積。 Mutation Res. 113:481-487.
    36. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1983)。 末梢血赤血球における小核の持続性。 マウスにおける慢性染色体切断の検出。 Mutatation Res. 104:367-369.
    37. Schlegel, R. and MacGregor, J.T. (1984). 正常ラットおよび脾臓摘出フィッシャー344ラットの末梢循環における小核化赤血球の持続性。 細胞遺伝学的スクリーニングへの影響。 Mutation Res. 127:169-174.
    38. Schlegel, R., MacGregor, J.T. and Everson, R.B. (1986)（1999 年）。 ヒト末梢血赤血球における微小核の定量による細胞遺伝学的損傷の評価。 Cancer Res. 46:3717-3721.
    39. Schmid, W. (1975)。 微小核試験. Mutation Res. 31:9-15.
    40. Schriever-Schwemmer G. and Adler I.-D. (1997). マウス骨髄細胞における微小核の鑑別。 CREST染色とセントロメアおよびテロメアDNAプローブを用いた蛍光In Situ Hybridizationとの比較。 Mutagenesis 9:333-340.
    41. Schriever-Schwemmer G., Kliesch U., and Adler I.-D. (1994). コルヒチンまたはアクリルアミドによって誘発された押出し小核は、マイナーおよびメジャーマウスDNAプローブによってペイントブラシ塗抹で識別されたラグド染色体をほとんど含んでいる。 Mutagenesis 12:201-207.
    42. Tice, R.R., Furedi-Machacek, M., Satterfield, D.N.A., Udumudi, A., Vasquez, M., Dunnick, J.K. (1998). p53 遺伝子をヘテロ接合したトランスジェニック雌マウスにおけるフェノールフタレイン慢性摂取中の小核化赤血球および DNA 損傷の測定。 Environ. Molec. Mutagen. 31:113-124.
    43. Tsuchimoto, T. and Matter, B.E. (1979). 変異原の生体内細胞遺伝学的スクリーニング法、特に小核試験について。 Arch. Toxicol. 42:239-248.
    44. Vanderkerken K., Vanparys Ph., Verschaeve L., and Kirsch-Volders M. (1989)． マウス骨髄小核アッセイは、アニューゲンとクラストゲンを区別するのに使用できる（The Mouse Bone Marrow Micronucleus Assay Can be Used to Distinguished Aneugens from Clastogens. Mutagenesis 4:6-11.
    45. Verschaeve L., Vanderkerken K., and Kirsch-Volders M. (1988). クラストゲンとアニューゲンによって誘発された微小核を識別する簡単な手段としてのC-バンディング。 Stain Technol. 63:351-354.
    46. Witt, K.L., Gulati, D.K., Kaur, P., Shelby, M.D. (1995)（1999 年）。 フェノールフタレイン マウスにおける小核化赤血球の誘発。 Mutation Res. 341:151-60.
    47. Yamamoto K.I. and Kikuchi Y. (1980). クラストゲンおよび紡錘体毒物によって誘発された微小核の直径の比較。 Mutation Res. 71:127-131.
    48. 山本恭一郎・菊池嘉一郎. (1981). 小核の時間反応と小核の誘発に対する変異原の複数回処理の効果に関する研究． Mutation Res. 90:163-173.

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