PEI promotes attachment of weakly anchoring cells and primary tissues
PC-12 cells are used as model of neuronal differentiation in laboratory.The PEEKERは細胞培養におけるポリエチレンイミンポリマーの付着因子の利用を提案する。 これらの細胞を神経成長因子（NGF）で処理すると、神経突起の伸長と交感神経の表現型の生化学的マーカーの発現が誘導されるからである。 PC-12細胞は、弱く固定された細胞として成長するため、PC-12細胞培養のプレコートプレートには、コラーゲンやポリリジンポリマーが頻繁に使用されます . PC-12細胞は、実験室において、未処理のウェル、あるいは多様な接着因子をプレコートしたウェル（マルチウェル-12組織培養皿）で培養し、細胞の基質への固定に及ぼす影響を観察した。 コーティング剤がない場合、細胞はウェルの中心に向かって集積する細胞のクラスターを形成する特徴的な傾向を示した。これらの細胞は細胞同士はしっかりと接着しているが、組織培養皿には非常に弱く接着している（図1D）。 この結果、細胞の分布が非常に不均一になり（ウェルの端にはほとんど細胞が残っていない）、洗浄手順や培地の交換時に細胞が著しく失われる。 PEIでプレートを前処理すると、ウェル内の細胞の分布は著しく均質になり、細胞はプレートにしっかりと接着し、クラスター化の傾向が非常に低くなった（図1A）。 比較のため、プレートを他の一般的なコーティング剤、コラーゲン（図1B）およびポリD-リジン（PDL；図1C）で前処理したところ、プレートへの細胞の接着が強固になり、細胞の分布がより均一になった。 PC-12細胞は、PEI（パネルA）、コラーゲン（パネルB）、PDL（パネルC）などの固定化促進因子で前処理したプラスチック表面には、未処理のプラスチック表面コントロール（パネルD）と比較してよく接着し、その中には細胞がクラスター状に存在し、基質に非常に緩く接着した（写真はプレートの中央と端の中間で撮影された）。 PEIコーティングにより、ディッシュの基材にしっかりと接着した細胞の均一な分布が得られた（パネルA）。 PEIは、ゼブラフィッシュの網膜摘出片の培養皿への接着を促進する（パネルE）。 この付着因子は、視神経の前処理病変によって軸索伸長を促された網膜摘出片の神経突起伸長に寄与した（パネルF）。 顕微鏡写真のバーは、パネルA〜Dでは25μm、パネルEでは50μm、パネルFでは100μmに相当する。
培養皿のPEI前処理で観察された固定強化特性をさらに試験するために、第2の系が利用された。 魚類の網膜は、神経再生の研究に使用されています。 魚の視神経に病変を与えると、再生反応が起こり、網膜の網膜神経節細胞（RGC）が軸索を標的組織であるテクトラルに向かって再伸長します。 このような「プライミング」された魚の網膜を摘出し、培養すると、長い神経突起の伸長が促進され、再生反応がin vitroで観察される。 しかし、この現象には細胞外マトリックスや接着因子（例えば、コラーゲンやPDLコーティング）の使用が必要である。なぜなら、摘出物はコーティングされていないプラスチック表面に対して非常に低い親和性を示すからである。 PEIが、ゼブラフィッシュ網膜抽出物からの軸索伸長を促進する接着因子として作用するかどうかを観察するために、実験が行われた。 コントロールのゼブラフィッシュの眼からの網膜摘出物は、PEIで前処理した培養皿に付着することができた（図1E）。 さらに、条件付け病変を受けた魚の網膜摘出物は、PEIを付着因子として培養すると、軸索を勢いよく伸ばすことができました（図1F）。
網膜摘出物の結果から、PEIコーティングディッシュに付着した神経細胞が分化し、基板によく付着する神経突起を生成できることが示唆されました。 この仮説をプロニューロンPC-12細胞で検証するために、PEIでコーティングしたディッシュに付着させた細胞でNGF処理による分化実験を行った。 NGFで処理したPC-12細胞は、数日間にわたってプレートにしっかりと接着したまま、神経突起のネットワークを形成した（図2）。 この結果は、PEIが分化の過程と神経突起のディッシュへの付着に寛容であることを示している。 分化した細胞は、免疫細胞化学実験の間、しっかりと固定されていた（M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García and R. P. Ballestero, unpublished results）
PEIをコートした培養皿に接着させたPC-12細胞の分化。 PEIでコーティングしたディッシュに付着したPC-12細胞は、NGFで処理するとプレートにしっかりと固定され、神経突起を伸展させたままであった。 写真は、100ng/mlのNGFで処理開始後、0時間（パネルA）、24時間（パネルB）、48時間（パネルC）、96時間（パネルD）の処理細胞の分化の経過を経時的に示したものである。 写真中のバーは25μmに相当する。
PEIおよび他の付着因子で前処理した培養皿への真核細胞のアンカーの強さ
プラスチック培養皿への強いアンカーを促進するPEIの能力を試験するために3種の細胞株が選択された。 PC-12とHEK-293細胞は、弱く固定されると前述しました。 一方、MYS細胞は、プラスチック培養皿に強く接着し、表面に細胞の単層を形成するように成長する初代線維芽細胞である。 多様な細胞のプレートへの定着強度を調べるため、等張緩衝液で4回連続洗浄した後、プレートに残った細胞を数える比色プロトコル（バイタル色素ニュートラルレッドに基づく）を使用するプロトコルを実施した。 多様な付着因子で前処理したプレートと、前処理をしないプレート（未処理）を比較した。 実験は3回に分けて行い、各処理を受けたプレートで保持された色素の平均値を算出した。 これらの平均値は、PEI前処理を行った場合の平均値に正規化し、すべての実験において任意の値である100.0%を割り当てた。 3つの細胞株を用いた代表的な実験の結果を図3に示す（各細胞株で少なくとも3つの独立した実験を行った）。 PC-12細胞は、PEI、コラーゲン、PDLでコートしたプレートにほぼ等しく接着した（相対細胞数は、PEI、コラーゲン、PDLでそれぞれ100.0% ± 5.3%, 89.3% ± 5.0%, 96.3% ± 5.8% ）。 しかし、未処理のプレートとPEIで前処理したプレートを比較すると、細胞の著しい損失が観察され、相対細胞数は43.9%±5.8%であった（図3A）。 HEK-293の場合、細胞はPEI-およびPDL-前処理したウェルの両方に強く接着した。 図3Bに示す代表的な実験では、これら2つの処理による相対数はそれぞれ100.0%±0.4%と96.8%±1.7%であった。 しかし、未処理のウェル（相対数8.3%±0.6%）、コラーゲンで前処理したウェル（11.5%±1.2%）にプレーティングすると、多くの細胞が失われたことから、これらの細胞はプラスチックやコラーゲンコートしたウェルにかなり緩く付着することが示唆された。 最後に、線維芽細胞（MYS細胞）を利用した場合、この細胞は、未処理のウェルを含む4つの表面すべてに、むしろよく接着するようであった（図3C）。 図3Cは代表的なプロットで、PEI、コラーゲン、PDLで前処理したウェル、または未処理のウェルでの相対的なMYS細胞数が、それぞれ100.0%±2.2%、85.9%±7.8%、73.7%±6.6%、77.1%±1.4%と表示されています。
PEI coatingは、固定力の弱い細胞の基質への固着を促進することがわかりました。 細胞の固定を促進する因子でコーティングされた培養皿への細胞の付着における強度を評価するために、複数回の洗浄を含むプロトコルによって誘発される細胞の損失を測定した。 PEIは、他の接着因子（コラーゲン、PDL）および未処理のコントロールディッシュと比較された。 相対的な細胞数は、PEIで処理したディッシュに任意の値100.0%を割り当てることで正規化された。 PEIコーティングは、PC-12細胞（グラフA）およびHEK-293細胞（グラフB）において、一般的に用いられる他の接着因子と比較して、有意に固定強度を向上させることができた。 強靭な固定力を持つ細胞株（MYS細胞、グラフC）の接着では、利点は観察されなかった。 棒グラフは、少なくとも3つの異なる実験の代表である3連アッセイの平均±標準偏差を示す（* 未処理対照よりも有意に高い、p < 0.01；**提示した実験では未処理対照よりも有意に高い、p < 0.01 ただし独立実験では有意性は保たれない）。
実験間のばらつきを示すために、独立した実験で得られた相対細胞数の平均値±標準偏差を各細胞株と処理について計算した（すべての実験でPEI前処理をしたウェルの数を100.0%としたため、このコーティング剤によるグローバル平均の値はすべての細胞株について正確に100.0%となることに注意すること）。 その他の処理についての比較結果を以下に示す。 PC-12 細胞では，コラーゲン前処理ウェル（n=4）で 81.5%±8.8，PDL 前処理ウェル（n=4）で 93.9%±21.2，未処理ウェル（n=4）で 52.1%±13.7% の相対カウントとなった． HEK-293 細胞では，コラーゲン前処理ウェル（n = 3）で 16.3% ± 12.7%，PDL 前処理ウェル（n = 3）で 99.6% ± 2.5%， 未処理ウェル（n = 3）で 9.0% ± 4.1% の相対数であった． MYS 細胞を用いた実験では、コラーゲン処理ウェルでの相対数の平均は 92.7%±16.2%（n = 3）、PDL 処理ウェルでは 71.1%±6.7%（n = 3）、無処理ウェルでは 78.4%±11.5%（n = 3）であった。 統計解析によると、未処理のプラスチックに対してPEI処理したディッシュへのPC-12およびHEK-293細胞の接着の増強は有意であり（それぞれp < 0.05 および p < 0.01, t-テスト解析）、一方MYS細胞については統計的に有意ではなかった（p > 0.05 ）。
弱く固定する細胞の付着因子としてのPEIの特性をさらに特徴付けるために、最適な細胞固定を提供できるPEIの投与量、PEIの存在から利益を得ることができる細胞数の範囲、及び付着因子としてのPEIの安定性を分析するための実験を実施した。 図4Aは、様々な用量のPEIでコーティングしたディッシュへのHEK-293細胞の付着強度を試験した代表的な実験からの結果を示す。 細胞数は、25μg/mlのPEIで処理した場合に得られた値に対して正規化し、100.0%とした。 その結果、PEIの濃度が2.5μg/ml以上で最大の付着促進効果が得られ、この濃度でプラスチックディッシュの表面がポリマーで完全にコーティングされたことが示唆された。 高濃度のポリマーは、溶液中に残った過剰のPEIを十分に除去すれば、細胞に毒性影響を与えないようであった（250μg/mlの濃度では、処理後に溶液を十分に除去しないとわずかな毒性作用が観察された）。 示された実験は、4つの独立した実験の代表である。 図4Bは、様々な数のPC-12細胞およびHEK-293細胞を用いて得られた結果を表す。 図は相対的な細胞数を示しており、各細胞株の数が最も多いPEI処理ウェル（3.2×105個のHEK-293細胞と1.5×106個のPC-12細胞）から得られた平均カウントに100.0％の任意の値が割り当てられている。 この結果から、PEIはPC-12とHEK-293細胞の両方で、幅広い細胞数の範囲で接着因子として機能することがわかった。 それ以下の細胞数では、ニュートラルレッドアッセイの感度の限界に近いため、信頼性の高い試験を行うことができなかった。 示された結果は、各細胞株で行われた少なくとも4つの独立した実験の代表である。 図4Cは、付着因子としてのPEIの安定性を試験するために実施された実験の結果を示している。 この実験では、一組のプレートをPEIで処理し、その後PBS中で4℃、10日間保持した。 2回目の実験では、PEIで処理したプレートを37℃のCO2インキュベーターで3日間保持し、24時間ごとに培地交換を行いました。 結果は、標準的なPEI処理プレートで得られた吸光度の平均値で規格化した相対細胞数を示し、任意の値である100.0%が与えられている。 この結果から、PEIコーティングは少なくとも10日間の冷蔵期間中、プラスチックディッシュの表面に安定に残り、培地中37℃でのインキュベーションや、培地交換を繰り返しても剥がれることはないことがわかった。 結果は、3重に行った4つの独立した実験の代表的なものである。
付着因子としてのPEIの特性の特性化。 グラフA：最適なコーティングのための濃度範囲を決定するために、PEIの用量を増加させることが試験された。 PEIは、2.5μg/ml以上の濃度で完全な付着促進を示しました。 グラフB：PEIは、広い範囲の細胞数でPC-12とHEK-293の両方の細胞の接着を促進した（テストした数はX軸に示されている）。 グラフC：PEIコーティングは、長時間の培養や培地交換においても培養皿表面への安定性を維持した（10d-PBS: 10d-PBS：PEI処理ディッシュをPBS中で4℃、10日間培養；96h-3MC：PEI処理ディッシュを37℃で3回の培地交換をしながら96時間培養). すべてのグラフにおいて、バーは少なくとも3つの独立した実験を代表する3重アッセイの平均±標準偏差を示す（* 未処理コントロールより有意に高い、p < 0.01）。
PEI前処理は弱アンカー性細胞のリポフェクションを強化する
リポフェクションによる真核細胞のトランスフェクションにはいくつかのステップ、培地の追加や交換が必要で、弱アンカー性細胞には負担がかかる場合があります。 また、細胞の脱落に注意しても、固定力が弱い細胞は、トランスフェクション複合体の取り込み効率が悪くなる可能性がある。 細胞培養ディッシュをPEIで前処理すると、その表面への細胞の接着強度が増すことから、この接着因子がリポフェクションによるトランスフェクションの収率にプラスの影響を与える可能性があると推測された。 この仮説を検証するために、先に調べたコーティング剤を用いて、上記の3つの細胞株を使用した。 トランスフェクションは、レポーター酵素であるβ-ガラクトシダーゼをコードするプラスミドで行われた。 トランスフェクションの収量は、トランスフェクトされた細胞からのライセートにおけるレポーター酵素活性の測定によってモニターされた。 各細胞株で少なくとも2つの独立したアッセイを3連で行った。 代表的なプロットを図5に示す。 収率（β-ガラクトシダーゼ活性）は、基準として100.0%としたPEIプレコートで得られた活性に対して正規化した。 一般に、細胞のプレートへの接着を促進する薬剤でプレコートすることにより、弱アンカーリング細胞においてトランスフェクション収率が向上することが観察された。 PC-12細胞の場合、PEI、コラーゲン、PDLでウェルをプレコートすると、未処理のウェルに比べ、トランスフェクション収量が2-3倍向上した：相対収量は、未処理のウェルが42.9 ± 2.2% であるのに対し、PEIは 100.0% ± 1.4%, コラーゲンは 87.0% ± 8.7%, PDLは 100.1%± 2.4% (Figure 5A). PEI前処理によるトランスフェクション収率の向上は、HEK-293細胞でより顕著に見られた。 図5Bの実験では、PEIで前処理したウェルの100.0%±8.4%と比較して、未処理のウェルの細胞の21.1%±3.4%の相対活性を示した（約5倍増）。 コラーゲンまたはPDLによる前処理は、より緩やかな誘導をもたらした（図5Bで約2-3倍）。 最も低い改善は、図3Bで先に観察されたHEK-293細胞の付着の低い増強と同様に、コラーゲンで観察された。 最後に、強く付着するMYS線維芽細胞については、トランスフェクション手順で付着因子を使用することによって観察される有意な正の効果はなかった。 すべての実験条件において、ばらつきは通常20%未満であった。 図5Cに示す代表的な実験では、未処理のウェルの方がPEI前処理プレートよりもわずかに高いトランスフェクション収率を示した（相対活性は、未処理のウェルが117.7 ± 3.2% vs 100.0% ± 4.2.0）。8%、またはコントロールの約1.2倍のトランスフェクション収率）。
PEI は弱く固定した細胞のトランスフェクションを強化する。 トランスフェクション収率は、β-ガラクトシダーゼアッセイによって決定され、培養皿のPEIコーティングで得られた収率（これには、100.0%の任意の値が割り当てられた）に対して正規化された。 PEIやその他の付着因子は、PC-12細胞（グラフA）やHEK-293細胞（グラフB）のような緩く付着する細胞株へのトランスフェクションを促進した。 MYS線維芽細胞のような強固に接着する細胞では、有意な効果は認められなかった（グラフC）。 棒グラフは、少なくとも2つの独立した実験を代表する3連アッセイの平均±標準偏差を示す（* 未処理のコントロールよりも有意に高い、p < 0.01）。
実施したすべての実験からの結果をまとめると、未処理のウェル上の細胞と比較してPEIに固定されたPC-12細胞のトランスフェクション収率で観察された平均倍率誘導（±標準偏差）は2.0であった。4倍（±0.1倍；n = 3）、一方、HEK-293細胞での増強は6.3倍（±0.5倍；n = 2）だった。t検定の統計解析は、両方の増加が有意（p < 0.05）であることを示唆している。 MYS細胞を用いた実験では、有意なトランスフェクションの増強は観察されず、PEIによる前処理によって平均1.0倍（±0.3倍；n＝2）の変化（処理なしの収率と基本的に同じ）
となった。