Joidenkin 4-hydroksikumariinijohdannaisten synteesi ja inhiboiva aktiivisuus HIV-1-proteaasille

Abstract

Kuusi uutta 4-hydroksikumariinijohdannaista syntetisoitiin rationaalisesti, todennettiin ja karakterisoitiin molekyylidockauksella käyttäen kristalli-HIV-1-proteaasia. Molekyylidockaustutkimukset ennustivat (7) ja (10) proteaasin vastaista aktiivisuutta. Merkittävimmät funktionaaliset ryhmät, jotka ovat vastuussa vuorovaikutuksesta HIV-1-proteaasin kanssa vetysidoksia muodostamalla, ovat pyraanihappi, atomi, laktonikarbonyylihappi ja yksi hydroksyyliryhmistä. Vastasyntetisoituja yhdisteitä testattiin biologisesti MT-4-soluilla HIV-1:n replikaation estämiseksi ja tutkittiin solujen suojaamista HIV:n sytopaattiselta vaikutukselta mitattuna solujen eloonjäämisellä MTT-testissä. Yksi johdannainen -7 osoitti 76-78 %:n estoa viruksen infektiivisyydelle IC50 = 0,01 nM, mikä on paljon vähemmän kuin suurin myrkytön pitoisuus (1 mM). Proteaasinestoaktiivisuus 7:n kahdessa eri pitoisuudessa oli 25 %. (7):n tutkimustulokset kannustavat kuitenkin käyttämään sitä farmakofoorina jatkosynteesiä ja HIV:n vastaisen aktiivisuuden arviointia varten.

1. Johdanto

Hmisen immuunikatoviruksen tyypin 1 (HIV-1) retrovirusproteaasi (PR) on yksi viruksen replikaation avainentsyymeistä. Se pilkkoo proteiinien ja glykoproteiinien esiasteita tuottaakseen aktiivisia virusentsyymejä ja rakenneproteiineja. Inaktiivinen HIV-1 PR johtaa ei-infektiivisiin virioneihin. Tämä seikka kannusti etsimään voimakkaita aineita, joilla on antiproteaasiaktiivisuus ja jotka estävät HIV-1:n replikaatiota. Viimeisten 12 vuoden aikana on kliinisesti otettu käyttöön useita peptidomimeettisiä analogeja, HIV-1 PR:n estäjiä (PI:t), mutta suurimmalla osalla niistä on huonoja farmakologisia ominaisuuksia, kuten huono oraalinen biologinen hyötyosuus, nopea puhdistuma ja siedettävyysongelmat, jotka liittyvät usein lypodystrofiaan ja dyslipidemiaan. Koska ne ovat peptidomimeettejä, virusisolaatit osoittavat nopeasti suurta resistenssiä ja ristiresistenssiä, vaikka ryhmän jäseniä käytettäisiinkin ennen kuin PI:t saatettiin markkinoille .

Uusien ei-peptidisten PI:iden, kuten Tipranaviirin ja Darunaviirin, kehitys osoitti vaikuttavaa tehoa PI-resistenttejä mutaatioita vastaan, joten ne pysyvät tärkeänä vaihtoehtona potilailla, joilla on tällainen resistenssi . Tämän vuoksi on etsittävä uusia ei-peptidisiä aineita, jotka estävät HIV-1-proteaasin toimintaa. Kokeelliset tiedot joistakin ei-peptidisistä aineista – 4-hydroksikumariineista (kuva 1) ja 4-hydroksypyraanijohdannaisista, jotka estävät HIV-1 PR:ää, tukevat tätä ajatusta .

Kuva 1

4-hydroksikumariinin rakenne.

Olemmekin jo pitkään olleet kiinnostuneita erilaisten ei-peptidisten aineiden, kuten 4-hydroksikumariinijohdannaisten, synteesistä ja arvioinnista , ja rohkaistuimme laajentamaan näitä kokeita. Tässä esitellään useita uusia synteesejä, joihin liittyy molekyylien telakointikokeita käyttäen kide-entsyymiä ja biologisen aktiivisuuden arviointia uusista ja lupaavista 4-hydroksikumariinijohdannaisista.

2. Tulokset ja keskustelu

2.1. 4-hydroksikumariinijohdannaisten synteesi

2.1.1. Aryylimetyleeni-β-ketoesterien synteesi

Eroittain substituoituja aromaattisia aldehydejä käytetään aryylimetyleeni-β-ketoesterien synteesiin Knoevenagel-reaktion kautta etyyliasetoasetaatin kanssa piperidiinin läsnä ollessa emäksisenä aineena ja jääetikkahapon kanssa. Nämä aryylimetyleeni-β-ketoesterit voidaan esittää kuvan 2 mukaisesti.

Kuva 2

Yleinen kemiallinen rakenne ja aryylimetyleeni-β-ketoesterien synteesi.

Reaktio 4-hydroksibentsaldehydin ja 2,4-pentanedionin välillä suoritettiin myös samoissa olosuhteissa kuin edellä on mainittu. Eristetty tuote oli 3-(4-hydroksi)fenyylimetyleeni-2,4-pentanedioni (6) , ks. kuva 3.

Kuva 3

3-(4-hydroksi)fenyylimetyleeni-2,4-pentanedionin (6) synteesi.

2.1.2.1.1. KUVA 3. 3-(4-hydroksi)fenyylimetyleeni-2,4-pentanedioni (6). Aryylimetyleeni-β-ketoesterien ja aryylimetyleeni-β-ketoesterien ja aryylimetyleeni-2,4-pentanedionien Michaelin additio 4-hydroksikumariiniin

Reaktion toinen vaihe on saatujen aryylimetyleeni-β-ketoesterien ja 4-hydroksikumariinin additio Michaelin reaktion avulla käyttäen natriummetoksidia tai piperidiiniä emäksisenä aineena . Tämä reaktio voidaan ilmaista kuvassa 4 esitetyllä tavalla.

Kuva 4

4-hydroksikumariinin ja aryylimetyleeni-β-ketoesterien Mikael-lisäys.

Kuva 5

4-hydroksikumariinin ja 3-(4-hydroksi)fenyylimetyleeni-2,4-pentaanidionin Mikaelin additio (6).

2.2. Molekyylinen telakointi

HIV-1-proteaasin vuorovaikutusta tutkittiin molekyylisen telakoinnin avulla joidenkin uusien syntetisoitujen 4-hydroksikumariinijohdannaisten kanssa. Vertailuna käytettiin kokeellisia tietoja joidenkin 4-hydroksikumariinien aktiivisuudesta.

Alustava molekyylidockaus tehtiin tunnettujen 4-hydroksikumariinijohdannaisten perusteella, joilla on HIV-1-proteaasin inhiboiva aktiivisuus (taulukko 1) . Ruudukko valitaan niin, että se on ylikokoinen verrattuna ligandiin, joka on aiemmin sitoutunut entsyymiin (tässä tapauksessa valittiin 7 Å:n kokoinen ruudukko).

𝐺-pistemäärän ja E-mallin funktioiden arvot on saatu tällä menetelmällä. Niitä kutsutaan pisteytysfunktioiksi ja ne ovat Δ𝐺bindin abstrakteja vastineita. Nämä funktiot ottavat huomioon vapaan energian, joka johtuu liuottimen vaikutuksista, proteiinin ja ligandin konformaatiomuutoksista, proteiinin ja ligandin välisistä vuorovaikutuksista (vetysidokset, ioniset vuorovaikutukset ja van der Waalsin voimat), proteiinin ja ligandin sisäisen rotaation jäätymisen aiheuttamasta vapaan energian häviöstä, kahden molekyylin assosioitumisen aiheuttamasta translaatio- ja rotaatioenergian häviöstä sekä värähtelymoodin muutoksista johtuvasta vapaasta energiasta (joka yleensä jätetään huomiotta). Jos nämä arvot ovat negatiivisempia yhdelle ligandille, se tarkoittaa, että tämän ligandin sitoutumiskyky on parempi. Kun ligandilla on sitoutumiskyky yhdessä määritetyssä konformaatiossa, ohjelma näyttää tämän ”hyvänä asentona”.

Tämä entsyymi koostuu kahdesta polypeptidiketjusta, ja se kuuluu aspartyyliproteaasiperheeseen, jossa kaksi aspartaattijäämää sijaitsee aktiivisen keskuksen alaosassa. Käytimme retroviruksen HIV-1-proteaasin kiderakennetta, joka oli sidottu peptidomimeettiseen inhibiittoriin BEA369 Protein Data Bankista pdb-koodilla 1EBY.

Voidaan päätellä, että ligandilla (1) on voimakkain sitoutumiskyky HIV-1-proteaasiin. Molekyylidockauksen tulokset vahvistavat kokeelliset tiedot ligandista (1).

Ligandien (1)-(5) osalta molekyylidockauksesta saadut 𝐺-pistemäärät ja E-mallin arvot testattujen yhdisteiden ryhmälle on esitetty taulukossa 2.

Tutkittujen 4-hydroksikumariinijohdannaisten ja HIV-1-proteaasin entsyymin aktiivisten paikkojen väliset vuorovaikutukset toteutuvat vetysidoksina ja van-der- Waalsin vuorovaikutuksilla. Aktiivisin yhdiste, jolla on esimerkiksi paras sitoutumisaktiivisuus, on yhdiste (10) ligandien (1)-(4) mukaan (pisteytysfunktioiden arvojen perusteella). Tämä seikka johtuu luultavasti vetysidosten muodostumisesta pyraanin happiatomin, laktonikarbonyylihapen ja yhden sivuketjusta aromaattiseen renkaaseen kiinnittyneen hydroksyyliryhmän (metapositiossa) välillä. Myös van der Waalsin vetovoimat vaikuttavat hyvään sitoutumiseen. Ligandin (5) mukaan aktiivisin on yhdiste (7). Yhdisteellä (7) on kaksi vetysidosta, joihin osallistuvat pyraanihappiatomi, laktonirenkaan karbonyylihappiatomi ja yksi ja vastaavat proteiinifragmentit. Van der Waalsin vetovoimavuorovaikutukset, joihin todennäköisesti m-nitro-ryhmä osallistuu yhden happiatominsa kanssa, ovat merkittäviä sitoutumisen kannalta. Yhdiste (7) näyttää olevan aktiivisempi kuin kokeelliset ligandit.

2.3. Biologinen aktiivisuus soluviljelyssä (MT-4-solut)

Sen jälkeen, kun eräiden 4-hydroksikumariinijohdannaisten aktiivisuus eristettyä HIV-PR:ää kohtaan oli osoitettu molekyylidockauskokeissa, olisi kiinnostavaa testata niitä edelleen HIV-1-infektoituneilla MT-4-soluilla. HIV:n vastaisen vaikutuksen arviointi tehtiin in vitro nopealla ja herkällä mikrotitteri-infektiomäärityksellä, joka perustuu sytolyysin kvantitointiin elintärkeän väriaineen (MTT) imeytymisen avulla infektion loppupisteenä. Lisäksi inhibiittoreiden vaikutusta HIV-1 III B -infektoituneen MT-4:n supernatanttien endogeeniseen käänteistranskriptaasiaktiivisuuteen (RT) pidettiin merkkinä HIV-1:n replikaation estokyvystä. MT-4-solut infektoitiin ja niitä inkuboitiin kullakin inhibiittorilla 72-96 tuntia, minkä jälkeen RT-aktiivisuus mitattiin solujen supernatanteista HS-Lenti Kit-RT-testin (Cavidi, Ruotsi) ohjeiden mukaisesti. Lisäksi tutkittiin äskettäin syntetisoitujen 4-hydroksikumariinien suoraa vaikutusta eksogeeniseen rekombinantti-RT:hen (rRT). Lisäksi kaikki yhdisteet testattiin HIV-1 PR:n vastaisen aktiivisuuden osalta. Taulukossa 3 esitetään MTT:tä käyttävän mikrotitteri-infektiomäärityksen ja HIV-1 PR-aktiivisuuden eston tulokset. Kokeet suoritettiin kunkin yhdisteen maksimaalisessa ei-myrkyllisessä pitoisuudessa (MNC).

Aluksi nähdään, että yhdisteillä (8), (7) ja (12) on korkeampi MNC, mikä tarkoittaa, että ne ovat sytotoksisempia kuin kolme muuta yhdistettä. Vain kaksi niistä (10) ja (7) estivät viruksen replikaatiota MT-4-soluissa, (7) aiheuttama esto oli huomattava (78 %). Käyttämällä 10-kertaisia viruslaimennoksia IC50:n arvoksi määritettiin 0,01 nM. Mikään yhdiste ei vaikuttanut sekä endogeeniseen että eksogeeniseen RT:hen. Tämä tarkoittaa, että RT ei ollut antiviraalisen vaikutuksen kohde. Kuten molekyylien telakointitutkimuksissa ennustettiin, HIV-1 PR-aktiivisuus estyi 24-25 %:lla (7) (tehtiin 5 erillistä arviointia). Infektiivisyyden estoa (noin 75 %) ja proteaasiaktiivisuutta (25 %) koskevien tietojen välinen epäjohdonmukaisuus, joka havaittiin (7:n) kohdalla, voitaisiin selittää jollain muulla aktiivisuudella, kuten integraasin vastaisella aktiivisuudella. Tiedetään hyvin, että jotkin 4-hydroksikumariinijohdannaiset ovat integraasin estäjiä.

Tässä artikkelissa kuvatut kokeet laajentavat aiemmin raportoituja siitä, että 4-hydroksikumariinijohdannaiset voisivat toimia uusina ei-peptidisinä PI:nä. Tipranaviirin ja darunaviirin tavoin ne voisivat olla tehokkaita potilailla, joilla on kehittynyt resistenssi peptidisille PI-lääkkeille. Erityisesti (7) voitaisiin käyttää farmakofoorina syntetisoitaessa uusia aktiivisempia johdannaisia HIV-1-proteaasia vastaan.

3. Päätelmät

Kuusi 4-hydroksikumariiniyhdistettä syntetisoitiin kaksivaiheisella synteesillä. Ensimmäinen vaihe on Knoevenagel-reaktio aromaattisten aldehydien ja etyyliasetoasetaatin tai asetyyliasetonin välillä. Toinen vaihe on saadun aryylimetyleeni-β-ketoesterin tai aryylimetyleeni-2,4-pentanedionin Michaelin additio 4-hydroksikumariinin kanssa. Tuotteet tunnistetaan ja karakterisoidaan 1H NMR:llä, EI-MS:llä, FTIR:llä ja alkuaineanalyysillä.

Tutkimus niiden sitoutumisaktiivisuudesta HIV-1 PR:ään tehtiin molekyylidockauksella. Kiteenä käytettiin HIV-1 PR:ää, joka oli sitoutunut peptidomimeettiseen inhibiittoriin BEA369. Korkein sitoutumisaktiivisuus osoittaa yhdistettä (10) kokeellisten ligandien (1), (2), (3) ja (4) mukaisesti ja yhdistettä (7) ligandin 5 mukaisesti. Tämä seikka johtuu todennäköisesti vetysidosten muodostumisesta pyraanin happiatomin, laktonin karbonyylihapen ja yhden sivuketjusta aromaattiseen renkaaseen kiinnittyneen hydroksyyliryhmän (metaposition) välille. Van der Waalsin vetovoimat vaikuttavat myös osaltaan hyvään sitoutumiseen.

Kaikki kuusi yhdistettä testattiin HIV-1 PR:n vastaisen aktiivisuuden osalta MT4-soluissa, jotka olivat saaneet HIV-1-infektion. Solujen eloonjäämistä arvioitiin MTT-testillä ja myös HIV-1 PR:n eston prosenttiosuus mitattiin. Yhdiste (7) osoitti suurimman HIV-1 PR:n eston (25 %) ja suurimman MT4-solujen eloonjäämisen (78 %). Yhdistettä (7) voitaisiin edelleen käyttää farmakofoorina syntetisoitaessa uusia aktiivisempia johdannaisia HIV-1 PR:ää vastaan.

4. Kokeellinen osa

4.1. Kokeellinen osa

4.1. Kokeellinen osa

4.2. 4-hydroksikumariinijohdannaisten synteesi

4.1.1. Materiaalit ja menetelmät

Kaikki lähtöaineet hankittiin Merckiltä, Sigma-Aldrichilta ja Flukalta. Niitä käytetään ilman lisäpuhdistusta. Sulamispisteet on mitattu avoimista kapillaariputkista Büchi 535 -sulamispistelaitteella. IR-spektrit tallennettiin Shimadzu FT-IR 8101 M -spektrometrillä nujolissa, ja taajuudet ilmaistaan cm-1:nä. 1H NMR-spektrit tallennettiin Brucker 250 MHz:n laitteessa DMSO-d6:ssa tai asetonissa käyttäen TMS:ää sisäisenä standardina (kemialliset siirtymät ilmoitetaan ppm-yksikköinä, kytkentävakiot (𝐽) Hz:nä). Lyhenteet ovat seuraavat: s: singletti, d: dubletti, dd: kaksoisdubletti, dq: kaksoiskvartetti, dqui: kaksoiskvintetti, t: tripletti ja m: multipletti.

Massaspektrianalyysi suoritettiin elektroni-ionisaatiolla massaspektrometri Hewlett-Packard 5973:lla 70 eV:n lämpötilassa. Yleinen menettely aryylimetyleeni-β-ketoesterien valmistamiseksi

Aromaattinen aldehydi ja etyyliasetaatti sekoitetaan ekvimolaarisina määrinä pyöreäpohjaisessa kolvissa. Reaktioseokseen lisätään myös piperidiini (0,03 mol) ja jääetikkahappo (0,04 mol). Jälkimmäistä sekoitetaan huoneenlämmössä 90 minuuttia. Kun reaktioseokseen on lisätty 20 ml eetteriä ja/tai 150 ml tislattua vettä, muodostuu erivärisiä kiteitä. Nämä kiteet suodatetaan ja pestään. Sitten ne kuivataan huoneenlämmössä ja kiteytetään uudelleen sopiviin liuottimiin – pääasiassa alkoholeihin (etanoli, propanoli ja 2-propanoli) ja veteen.

4.1.3. Menetelmä 3-(4-Hydroksi)-fenyylimetyleeni-2,4-pentandionin (6) valmistamiseksi (6)

4-Hydroksibentsaldehydi (3,66 g, 0,03 mol) ja asetyyliasetoni (5,14 ml, 0,05 mol) sekoitetaan pyöreäpohjaisessa pullossa. Reaktioseokseen lisätään myös piperidiini (0,03 mol) ja jääetikkahappo (0,04 mol). Jälkimmäistä sekoitetaan huoneenlämmössä 120 minuuttia. Sen jälkeen reaktioseokseen lisätään 150 ml tislattua vettä. Syntyy erivärisiä kiteitä. Nämä kiteet suodatetaan ja pestään. Sitten ne kuivataan huoneenlämmössä ja kiteytetään uudelleen metyleenikloridiin.

4.1.4. Yleinen menetelmä kondensaatiotuotteiden valmistamiseksi 4-hydroksikumariinin kanssa

Edellisessä reaktiossa saatu aryylideeni-β-ketoesteri ja 4-hydroksikumariini sekoitetaan ekvimolaarisina määrinä 25-30 ml:ssa metanolia (käytetään liuottimena). Reagensseihin lisätään myös natriummetoksidia (0,003 mol) emäksisenä aineena. Reaktioseosta keitetään ja sekoitetaan 60 tuntia takaisinvirtauksessa. Reaktiota valvotaan TLC:llä (heksaani : asetoni = 2 : 1 tai heksaani : asetoni : kloroformi : metanoli = 5 : 3 : 2 : 1). Kun reagenssimäärät olivat loppuneet, lämmitys lopetettiin. Reaktioseoksen jäännös suodatettiin ja pestiin kuumalla vedellä reagoimattoman 4-hydroksikumariinin poistamiseksi. Tämän jälkeen jäännös kuivattiin huoneenlämmössä ja kiteytettiin uudelleen sopivaan liuottimeen (metanoliin, etanoliin tai 2-propanoliin).

4.1.5. 3-(4-Hydroksibentsylideeni)-2,4-pentanedionin (SS-23) ja 4-hydroksikumarin välinen Michaelin additio

3-(4-Hydroksibentsylideeni)-2,4-pentanedioni (1,02 g, 0,005 mol) ja 4-hydroksikumariini (0,81 g, 0,005 mol) sekoitetaan lievässä ylijäämässä 4-hydroksikumariinia 15-25 ml:ssa metanolia. Reagensseihin lisätään myös piperidiini (0,003 mol) emäksisenä aineena. Reaktioseosta keitetään ja sekoitetaan 60 tuntia takaisinvirtauksessa. Reaktiota valvotaan TLC:llä (heksaani : kloroformi : etikkahappo = 10 : 10 : 4, heksaani : kloroformi : etikkahappo = 10 : 10 : 2, heksaani : asetoni = 2 : 1). Kun reagenssimäärät olivat loppuneet, lämmitys lopetettiin. Reaktioseoksen jäännös suodatettiin pois ja pestiin kuumalla vedellä reagoimattoman 4-hydroksikumariinin poistamiseksi. Tämän jälkeen jäännös kuivattiin huoneenlämmössä ja kiteytettiin uudelleen asetoniin.

4.2. Aine, joka on poistettu. Molekyylinen telakointi

Kaikki molekyyliset telakointilaskelmat suoritetaan witsh Maestro Macromodel Glide -ohjelmilla Schrodinger-paketista . Kaikki rakenteet (kokeellisesti testatut ja uudet) minimoidaan Macromodel-ohjelmalla käyttäen OPLS2005-voimakenttää ja 5000 iteraatiota. HIV-1-proteaasientsyymin röntgenrakenne yhdessä inhibiittorin BEA369 kanssa on saatu Protein Data Bankista PDB-koodilla 1EBY.

4.3. Solulinjat ja virukset

MT-4-ihmisen lymfoblastoidisuspensiosolulinja, jonka on ystävällisesti toimittanut Gianfranco Pancino- Pasteur-instituutti (Unite de Regulation des Infections Retrovirales, Pariisi, Ranska), edustaa klassista mallia kokeelliselle tuottoisalle infektiolle HIV-1:n III B-kannalla, ja sitä käytetään rutiininomaisena kohteena tutkittaessa HIV:n oletettujen inhibiittoreiden vaikutusta soluviljelyssä.

HIV-1:n lähteenä käytettiin H9/HTLV III B -linjan supernatanttia, joka oli tohtori R. Gallon (NIH, Yhdysvallat) lahja. Supernatantit kerättiin ja sentrifugoitiin solujen poistamiseksi, ja viruskannat valmistettiin tunnetulla p24-antigeenipitoisuudella (460 pg/mL, Murex HIV Antigen mAB-testi), RT-aktiivisuudella (565,3 pg RT/mL, HS-Lenti RT Activity Kit, Cavidi, Ruotsi) ja infektiivisyydellä (2 × 106 infektoivaa virionia/mL, mikrotiteri-infektiomääritys) . MT-4- ja H9/HTLV III B-soluja kasvatettiin RPMI 1640:ssä, jota täydennettiin 10 %:lla FCS:llä (invitrogen).

4.4. Sytotoksisuustestit ja antiviraaliset määritykset soluviljelyssä

Tutkittavat yhdisteet liuotettiin ensin DMSO:han ja laimennettiin edelleen solukasvatusmediumiin ilman sikiöseerumia. Kaikki liuokset valmistettiin ex tempore.

Tarkasteltiin seuraavia parametreja: sytotoksinen pitoisuus 50-CC50, jos mahdollista (pitoisuus, joka estää 50 %:n MT-2-solujen kuoleman), maksimaalinen ei-toksinen pitoisuus-MNC ja inhiboiva pitoisuus 50-IC50 (pitoisuus, joka estää 50 %:lla viruksen replikaation). CC50 ja MNC havaittiin MTT:n imeytymismäärityksellä. IC50 tutkittiin MT-4-soluilla mikrotitteri-infektiomäärityksellä, jossa tutkittiin solujen suojautumista HIV:n sytopaattiselta vaikutukselta MTT-testillä mitattuna. Kokeet akuuteissa infektio-olosuhteissa tehtiin 96-kuoppaisissa mikrolevyissä 6-8 rinnakkaista koetta/koe. Kunkin kokeen yhteydessä tehtiin solukontrollit (MT-4-solut, joissa oli vain väliaine) ja viruskontrollit (viruksella infektoidut MT-4-solut). Virustutkimuksia varten HIV:tä lisättiin kuhunkin kuoppaan, jotta infektiokertoimeksi saatiin 0,1, lukuun ottamatta solukontrolleja. Viruksen annettiin kiinnittyä tunnin ajan 37 °C:ssa/5 % CO2:ssa. Levyjä inkuboitiin 72-96 tuntia 37°C/5% CO2:ssa. Tämän jälkeen tehtiin MTT-testi kuvatulla tavalla ja elinkelpoisten solujen absorbanssi mitattiin kolorimetrisesti A540 nm:ssä. Kaikista kokeista laskettiin kunkin sarakkeen keskiarvo (vain jos A540-arvot eivät eronneet toisistaan ±10 %:n sisällä). Antiviraalisia määrityksiä varten koe- ja kontrollirivien keskiarvoja verrattiin ja suojattujen solujen prosenttiosuus (solujen eloonjääminen) sopivalla aineen pitoisuudella piirrettiin aineen pitoisuutta vastaan IC50:n saamiseksi. Solujen eloonjääminen (solusuojausprosentti) laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: =%cellprotectionA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControl-A540ControlHIV×100,(1) jossa 𝑋 on tutkittavan yhdisteen sopivalla pitoisuudella käsiteltyjen HIV-infektoitujen solujen A540:n keskiarvo; kontrolli-HIV on HIV-infektoitujen solujen A540:n keskiarvo ilman yhdisteen lisäystä siihen; solukontrolli on infektoitumattomien ja inhibiittorilla käsittelemättöminä olleiden solujen A540:n keskiarvo.

Viiteaineena käytettiin ABC:tä (Abakaviiri tunnettu nukleosidinen käänteistranskriptaasin estäjä-NRTI) ja pepstatiinia.

4.4.1. Vertailuaine. Endogeeninen RT-aktiivisuus ja yhdisteiden suora vaikutus RT:hen

Testattiin HS-Lenti Kit-RT-määrityksellä (Cavidi, Ruotsi). Kit sisältää rekombinantti-RT:tä (rRT) standardina, mikä mahdollistaa RT:n kvantifioinnin. Endogeenisen RT:n määritystä varten testattiin HIV-1-infektoitujen/infektoimattomien MT-4-solujen supernatanttia sen jälkeen, kun niitä oli inkuboitu yhdisteiden kanssa tai ilman niitä, valmistajan ohjeiden mukaisesti. RT-aktiivisuus supernatantissa laskettiin (pg/ml) kunkin kitin HIV-1 rRT-standardista. Yhdisteiden suora vaikutus rRT-aktiivisuuteen mitattiin samalla kitillä, millä pyrittiin osoittamaan, että RT on antiviraalisen vaikutuksen kohde. Inhibiittorista valmistettiin asianmukaiset laimennokset kontrollipuskuriin ja lisättiin reaktioseokseen. Reaktiota ajettiin 3 tuntia 33 °C:ssa. Standardilaimennosten RT-aktiivisuutta verrattiin aktiivisuuteen, johon yhdisteitä oli lisätty, tai kontrolleihin (joihin oli lisätty vain inkubointiseosta ilman yhdisteitä).

4.4.2. Antiproteaasiaktiivisuuden osoittaminen testeillä, joissa käytetään natiivia virusproteaasia

Menetelmää, jonka Broglia et al. (2006) ovat aiemmin kuvanneet rekombinanttiproteaasiaktiivisuuden osoittamiseksi, muutettiin käyttämään natiivia virusproteaasia . Natiivin HIV-1-proteaasin lähteenä käytettiin jälleen suspensiota kroonisesti infektoituneista H9/HTLV IIIB -solujen supernatanteista saadusta konsentroidusta viruskannasta (50x). Viruspartikkelien lyysi ja aktiivisen entsyymin (proteaasin) vapauttaminen suoritettiin käyttämällä hajotuspuskuria (lyysiä), joka sisälsi 2,5 % Triton X-100:a fosfaattipuskurissa. Virusta sisältävän kudosviljelynesteen konsentrointi tehtiin ultrasentrifugoimalla Biofuge Stratos -laitteessa (Heraeus) 1 tunnin ajan 4 °C:ssa ja 35000 kierrosta/min. Pelletti suspendoitiin uudelleen, jotta saatiin 50-kertainen konsentraatti hajotuspuskurissa.

Jokaista koetta varten valmistettiin seuraava reaktioseos : 1000 𝜇L fosfaattipuskuria (20 mM, pH 6.0); 20 𝜇L HIV-proteaasisubstraatti III (1 𝜇g/mL, 760 𝜇M; Bachem, Sveitsi) DMSO:ssa, valmistettu ex tempore; 20 μL entsyymiä (HIV-kanta), joka on otettu liuoksesta, joka sisälsi 25 𝜇L hajottavaa (lyysi)puskuria (lysis) + 100 μL HIV-kantaa, jota inkuboitiin 40 min 37 °C:ssa ennen koetta.

HIV-1 PR-aktiivisuus mitattiin suoralla spektrofotometrisellä lukemalla entsyymireaktion substraatin hyväksikäyttö 300 nm:ssä huoneenlämmössä ja 1 cm:n polunpituudella käyttäen T80 + UV-Vis -spektrofotometriä (PG instruments). Reaktion alkunopeus (V0) säädettiin 0,0020-0,0030 ΔAbs/min:ksi muuttamalla entsyymiaktiivisuutta (viruskonsentraatiota). Testattu yhdiste ja vertailuinhibiittori (tässä käytetty pepstatiini) lisättiin reaktioseokseen ennen entsyymiä, jotta inhiboiva vaikutus voitiin seuloa. IC50 määriteltiin testatun yhdisteen pitoisuudeksi, joka vähentää reaktion nopeutta 50 % alkuperäisestä nopeudesta ilman testattua (viite)yhdistettä.