Kaksi aminohappojäännöstä määrittää TRPV3- ja TRPV4-ionikanavien 2-APB-herkkyyden

Tulokset

2-APB-vasteisiin spesifisesti vaikuttavien mutaatioiden tunnistaminen.

Seuloimme hiiren TRPV3-mutaatiokirjastoa, joka koostui ≈14 000:sta ≈14 000:sta cDNA-konstruktiosta, jotka sisälsivät virheenalttiilla PCR:llä aikaansaatuja mutaatioita, joita oli keskimäärin 2,5 mutaatioita kloonissa. Mutanttikonstruktiot transfektoitiin ihmisen alkion munuaissoluihin (HEK293), ja lämmön (42 °C), 25 μM 2-APB:n ja 1,75 mM kamferin herättämiä kalsiumreaktioita seurattiin fluoresenssikuvauslevylukijalla (FLIPR). Kuvasimme hiljattain TRPV3:n lämpöaktivaatiolle spesifisesti välttämättömien jäännösten tunnistamisen (20). Tässä keskityimme 2-APB:n ja kamferin tietokokonaisuuteen tunnistamaan jäännökset, joita tarvitaan erityisesti kemiallisiin vasteisiin.

Valitsimme kloonit, jotka osoittivat normaaleja vasteita toiselle kemikaalille, mutta joiden aktivoituminen toisella kemikaalilla oli merkittävästi vähentynyt (valintakriteerit, ks. Menetelmät). Positiiviset kloonit poimittiin, kasvatettiin uudelleen, mitattiin täydelliset annos-vastekäyrät kutakin ärsykettä vastaan ja laskettiin EC50-arvot (ks. Menetelmät). Seitsemän mutanttikloonia vahvistettiin spesifisesti 2-APB-puutteellisiksi, ja ne sekvensoitiin. Huomionarvoista oli, että kaikki 7 kloonia sisälsivät mutaatioita 1:ssä 2:sta jäännöksestä. Ensimmäinen, histidiini (H) 426, on sytoplasmisen N-päätteen alueella, ankyriini- ja transmembraanidomeenien välissä. Seulonnassa tunnistettiin 4 erilaista H426:n substituutiota (taulukko 1). Toinen, arginiini (R) 696, esiintyy C-terminaalisessa sytoplasmisessa TRP-laatikossa (IWRLQR), joka on TRP-kanavien konservoitunut alue (2, 3). Tämän jäännöksen 3 mutaatiossa on sama läheisesti toisiinsa liittyvä arginiinin ja lysiinin välinen substituutio. Kaikki 7 mutaatiota aiheuttivat vakavia puutteita 2-APB-vasteissa vaikuttamatta kamferivasteisiin (taulukko 1). Vaikka myös joitakin kamferipuutteisia klooneja tunnistettiin, ne olivat suhteellisen hienovaraisempia mutaatioita, jotka siirsivät kamferin EC50-arvoja ≈2-kertaisesti tai vähemmän (tietoja ei ole esitetty). Tästä syystä keskityimme tässä tutkimuksessa kahteen residuaaliin, jotka aiheuttavat spesifisesti >10-kertaisen 2-APB-puutoksen.

TRPV3-H426- ja TRPV3-R696-kanavien sähköfysiologinen karakterisointi.

FLIPR on epäsuora tapa mitata ionikanavien aktiivisuutta. FLIPR-tulostemme vahvistamiseksi käytimme patch clamp -tekniikkaa ja mittasimme villityypin hiiren TRPV3-, TRPV3-H426N- ja TRPV3-R696K-kanavien kokosoluvirtoja, kun 2-APB (1 μM – 3 mM) tai kamferi (0,3 – 20 mM) annosteltiin yksitellen kylvyssä matalista korkeisiin pitoisuuksiin (Kuva 1 ja Kuva S1). Pitoisuusriippuvaisella tavalla 2-APB aktivoi virrat HEK293-soluissa, jotka transfektoitiin villin tyypin TRPV3:lla, keskimääräisillä EC50-arvoilla, jotka olivat 25,9 ± 0,3 (nHill = 2,3) ja 36,8 ± 3 .6 μM (nHill = 3,3) vastaavasti +100 ja -100 mV:n jännitteellä (kuva 1A; kuva S1A); 2-APB ei aiheuttanut mitattavissa olevia virtoja HEK293-soluissa, jotka oli transfektoitu TRPV3-H426N:llä 100 μM:iin asti. Kuitenkin 2-APB:n pitoisuudet, jotka ovat kyllästäviä villityypin TRPV3:lle (0,3-3 mM), pystyivät aktivoimaan virrat tässä mutantissa pitoisuusriippuvaisella tavalla (Kuva 1A; Kuva S1A). Näin ollen TRPV3-H426N osoitti >10-kertaista EC50-siirtymää 2-APB-riippuvaisessa aktivoinnissa, eikä vaste koskaan saavuttanut kylläisyyttä. Rinnakkaisissa kokeissa kamferi aktivoi myös virtoja HEK293-soluissa, jotka transfektoitiin villin tyypin TRPV3: lla, konsentraatiosta riippuvaisella tavalla, jolloin EC50-arvot olivat 6,7 ± 0,1 (nHill = 7,8) ja 7,0 ± 0,1 mM (nHill = 8,4) vastaavasti +100 ja -100 mV: ssä. Tärkeää on, että villin tyypin kaltaisia vasteita kamferille havaittiin HEK293-soluissa, jotka transfektoitiin TRPV3-H426N:llä , mikä vahvistaa, että kamferin aktivaatio ei ole muuttunut tässä mutantissa (Kuva 1A; Kuva S1B).

Kokosolujen patch-clamp-kokeissa 2-APB indusoi myös minimaalisen TRPV3-R696K-aktivoitumisen. Kun +100 mV, 2-APB alkoi aktivoida tätä mutanttikanavaa ilmentäviä HEK293-soluja ≈3 μM:ssä ja saavutti kylläisyyden 30 μM:ssä, jolloin EC50 oli 10,0 ± 1,3 μM (nHill = 2,1). Korkeammat 2-APB:n pitoisuudet (>30 μM) herättivät desensitisoivan virran, jolla oli ”off-vaste” 2-APB:n huuhtelun jälkeen, ilmiö, jota kuvataan yksityiskohtaisesti jäljempänä. Kuitenkin -100 mV:ssä 2-APB ei onnistunut aktivoimaan R696K-mutaatiokanavia edes 1 mM:n pitoisuudessa (Kuva 1B; Kuva S1A). Maksimaalinen 2-APB-vaste 1 mM: ssä -100 mV: ssä oli -2,3 ± 1,4 pA / pF (n = 6), mikä on huomattavasti pienempi (> 10-kertainen) kuin villityypin TRPV3-kanavilla (-482,1 ± 69,2 pA / pF 300 μM: ssä, n = 17), mikä viittaa siihen, että 2-APB: n herättämä maksimaalinen kanavavaste on pienentynyt TRPV3-R696K-mutaatiossa. Kamferi aktivoi kuitenkin samanlaisia vasteita TRPV3- ja TRPV3-R696K-transfektoiduissa HEK293-soluissa (Kuva 1B; Kuva S1B). Siksi ensimmäiset elektrofysiologiset tiedot vahvistivat seulontatuloksemme, joiden mukaan TRPV3-H426N- ja TRPV3-R696K-mutantit ovat puutteellisia 2-APB-reaktiivisuudessa vaikuttamatta kanavan yleiseen toimintaan, jota testattiin niiden kyvyllä reagoida kamferiin.

Seuraavaksi kysyimme, mitkä sivuketjuominaisuudet H426: n ja R696: n sivuketjuominaisuudet ovat ratkaisevassa asemassa, jotta TRPV3-aktivoituu 2-APB: llä. Mutoimme erikseen asemat 426 ja 696 kaikkiin muihin aminohappoihin ja mittasimme FLIPR-annos-vastekäyrät sekä 2-APB:lle että kamferille. Mielenkiintoista oli, että kaikkien H426-mutanttien 2-APB-vasteet vähenivät ja EC50-arvot kasvoivat voimakkaasti (> 10-kertaisiksi) (taulukko S1). Useimmilla mutanteilla oli normaalit kamferivasteet lukuun ottamatta kierteitä rikkovaa proliinisubstituutiota, jolla kampferin EC50-arvo kasvoi ≈2-kertaiseksi. Tiedot ovat johdonmukaisia ensisijaisen seulontamme tuloksen kanssa, jossa tunnistettiin 4 erilaista substituutiota, jotka johtavat 2-APB-puutokseen tässä asemassa. Aromaattisia sivuketjuja F, T ja W kantavat mutaatiokanavat eivät reagoineet kamferiin tai 2-APB:hen. Useimmat R696-mutaatiot osoittivat kuitenkin vähentyneitä 2-APB-vasteita, mutta myös maksimaaliset kamferivasteet (20 mM) olivat pienentyneet, mikä osoittaa, että nämä mutaatiot vaikuttavat kanavan yleiseen ilmentymiseen tai toimintaan (taulukko S2). Tämä tulos on myös johdonmukainen ensisijaisen seulan alkuperäisen tuloksemme kanssa, jossa vain lysiinisubstituution tunnistettiin olevan spesifisesti tarpeen 2-APB:lle tässä jäännöksessä. R696F osoitti myös jonkin verran 2-APB-spesifistä vajetta, vaikka maksimaaliset kamferivasteet vaikuttivat hieman. Mutantit R696D, R696G, R696N, R696P, R696S ja R696T eivät osoittaneet merkittäviä vasteita 2-APB:lle tai kamferille verrattuna pcDNA-vektorilla transfektoituihin soluihin.

Jännitteestä riippuvainen vaste säilyi koskemattomana 2-APB:n mutanteissa.

Jännitteestä riippuvuudella on osoitettu olevan tärkeitä rooleja TRP-kanavien aktivoitumisessa ja portin avautumisessa (1, 10-12, 21). Ilman kemiallisia stimulaattoreita (esimerkiksi kamferia tai 2-APB:tä) jänniteaskeleet -120-180 mV (20 mV:n askel) eivät aktivoineet virtoja HEK293-soluissa, jotka oli transfektoitu villityyppisellä TRPV3:lla, mikä osoittaa, että TRPV3:a (toisin kuin TRPV1:tä ja TRPM8:aa) ei aktivoida pelkällä jännitteellä tässä testatulla vaihteluvälialueella (20, 22). Kuitenkin 30 μM 2-APB:n läsnä ollessa aktivoitui jännitteestä riippuvainen virta (kuva S2A). Odotetusti TRPV3-H426N:ssä ei havaittu havaittavaa jännitemoduloitua virtaa, kun sitä käsiteltiin 30 μM 2-APB:llä (Kuva S2B). Kuitenkin 6 mM kamferia herätti jännite-riippuvaisen virran HEK293-soluissa, jotka ilmentävät villityyppistä TRPV3:a (V1/2 81,3 ± 2,6 mV) (Kuva S2 A ja D) ja TRPV3-H426N:ää (V1/2 81,3 ± 2,5 mV) (Kuva S2 B ja D). TRPV3-H426N:n tavoin TRPV3-R696K:ssa ei ollut havaittavissa jännitemoduloitua virtaa, kun sitä käsiteltiin 30 μM 2-APB:llä (Kuva S2C). Kamferi aktivoi kuitenkin jännitteestä riippuvan virran, jonka V1/2 oli 81,1 ± 5,4 mV (Kuva S2 C ja D). Nämä tulokset osoittavat, että jännitemodulaatio on ehjä TRPV3-H426N:ssä ja TRPV3-R696K:ssa, ja viittaavat siihen, että jännite-riippuvuuden menetys ei todennäköisesti ole syynä vähentyneisiin vasteisiin 2-APB:lle näissä mutanttikanavissa.

Lämpötilaherkkyys TRPV3-H426N:ssä ja TRPV3-R696K:ssa.

Lämpötila-herkkyys on TRPV3-kanavan toiminnalle ominainen piirre (14, 16, 23). Siksi kysyimme, onko lämpötila-aktivoituminen muuttunut TRPV3-H426N- ja TRPV3-R696K-klooneissa. Mittasimme lämpötilan (25-42 °C) aiheuttamaa aktivoitumista HEK293-soluissa, jotka oli transfektoitu villityyppisellä TRPV3:lla, TRPV3-H426N:llä tai TRPV3-R696K-mutantilla FLIPR-määrityksessä. TRPV3-H426N:n lämpövasteet olivat joko yhtä suuria tai hieman suurempia kuin villityypin TRPV3-vasteet (n = 4 koetta), mikä viittaa siihen, että 2-APB- ja lämpöaktivointi voidaan erottaa toisistaan (kuva S2E; ja tietoja ei ole esitetty). Lämpövasteet TRPV3-R696K:ssa olivat kuitenkin paljon pienempiä verrattuna villityyppiin (n = 3 koetta), mikä viittaa siihen, että tämä mutantti ei muuta spesifisesti 2-APB-aktivoitumista (Kuva S2E).

TRPV3-R696K:n kalsiumriippuvainen desensitisaatio.

Mielenkiintoinen piirre 2-APB-vasteessa TRPV3-R696K-transfektoiduissa HEK293-soluissa on nopea desensitisaatio >30 μM 2-APB: ssä ja off-vaste 2-APB: lle korkeissa pitoisuuksissa (Kuva S3). Tämä ilmiö on ristiriidassa villin tyypin TRPV3:n kanssa, joka herkistyy vasteena kemikaalien tai lämmön toistuvalle/jatkuvalle stimulaatiolle (14, 16). TRPV3-herkistymisen taustalla olevan mekanismin ehdotetaan olevan tämän kanavan kalsiumin eston menetys (22). Koska useimpien muiden TRP-kanavien (kuten TRPV1 ja TRPA1) desensitisaatio kemiallisiin tai lämpöärsykkeisiin riippuu myös solunulkoisesta kalsiumista (24, 25), lähdimme testaamaan, onko solunulkoisella kalsiumilla merkitystä 2-APB:n aiheuttamissa desensitisaatiovasteissa TRVP3-R696K:ssa. Yllättäen ilman ekstrasellulaarista kalsiumia 100 μM 2-APB aktivoi vankan, villin tyypin kaltaisen sisäänpäin suuntautuvan ja ulospäin suuntautuvan virran TRPV3-R696K:ssa (TRPV3-R696K:n virrantiheys: 755.7 ± 200,0 pA/pF +100 mV:ssä, -641,2 ± 133,9 pA/pF -100 mV:ssä (n = 5); villityypin TRPV3: 615,0 ± 266,7 pA/pF +100 mV:ssä ja -471,0 ± 83,2 pA/pF -100 mV:ssä, n = 9) (Kuva S4 A ja B). Tämä tulos viittaa siihen, että arginiinin korvaaminen lysiinillä positiossa 696 TRPV3:n TRP-laatikossa ajaa kanavan kalsiumriippuvaisella tavalla desensitisoivaan tilaan 2-APB:n mutta ei kamferistimulaation yhteydessä. Huokossilmukan domeenin oletettu Ca2+-sitova jäännös, aspartaatti 641, on konservoitunut kaikissa TRPV-kanavissa, ja se on kriittinen TRP-kanavien permeaatio-ominaisuuksien kannalta (26, 27). D641:n mutaation asparagiiniksi (N) on osoitettu vähentävän TRPV3:n ja muiden TRP-kanavien ruteniumpunasalpausta ja suuren affiniteetin ekstrasellulaarista kalsiumin estoa (17, 22, 26, 27). Siksi tutkimme, voisiko D641N-mutaatio vapauttaa TRPV3-R696K-kloonin kalsium-riippuvaisesta 2-APB-vasteen menetyksestä. FLIPR-määrityksessä TRPV3-D641N:n EC50-arvo oli 2,8 ± 1,3 μM (nHill = 0,7), mikä on noin puolet villityypin TRPV3:n arvosta (5,7 ± 1,2 μM, nHill = 1,1). Kaksoismutantin TRVP3-D641N/R696K EC50 oli 3,3 ± 1,1 μM (nHill = 1,1), mikä osoittaa, että D641N-mutaatio palautti TRPV3-R696K:n 2-APB-vasteen täysin. Odotetusti kamferivaste oli samanlainen TRPV3:n, TRPV3-R696K:n, TRPV3-D641N:n ja TRPV3-D641N/R696K:n välillä (Kuva S4 C ja D). Nämä tutkimukset osoittavat, että TRPV3-R696 ei ole puhtaasti 2-APB-mutaatio. Havaitut puutteet ovat kalsium-välitteisiä, ja ne vaikuttavat 2-APB-vasteisiin mutta eivät kamferivasteisiin.

2-APB-herkkyys TRPV3-ortologeissa.

Aminohappokonservoinnit ja ortologien väliset variaatiot ovat käyttökelpoisia apuvälineitä, kun halutaan selvittää proteiinien, mukaan lukien TRP-kanavien, rakenne-toimintasuhteita (28, 29). Siksi kysyimme, onko näillä TRPV3-ortologeilla vertailukelpoiset kamferi- ja 2-APB-vasteet. Ihmisen, koiran ja sammakon TRPV3-kanavilla, joilla on histidiinit hiiren vastaavassa asemassa 426 (kuva 2A), on todellakin samanlaiset 2-APB-vasteet, kun niitä yliekspressoidaan HEK293-soluissa (vaikkakin Xenopus tropicalis TRPV3:n kamferivasteet vähenivät verrattuna hiiren villiintyneeseen TRPV3:een) (kuva 2C). Odotetusti, kun ihmisen, koiran ja sammakon H426 mutaati N:ksi, 2-APB-konsentraatiovasteiden käyrät siirtyivät voimakkaasti oikealle jokaisessa näistä TRPV3-ortologeista (Kuva 2B). Tämäkään mutaatio ei vähentänyt kamferiherkkyyttä verrattuna villityyppisiin TRPV3-ortologeihin (Kuva 2C). Päinvastoin, sekä ihmisen että sammakon TRPV3 H426N-mutaatioilla oli hieman suurempi kamferiherkkyys kuin niiden villityyppisillä vastineilla. Nämä tulokset osoittavat, että TRPV3:n 2-APB-aktivointimekanismi saattaa olla konservoitu eri lajeissa.

Mielenkiintoista on, että vaikka R696 on konservoitunut TRPV3:n TRP-laatikossa kaikilla lajeilla, hiiren 426:ta vastaava asema kanan TRPV3:ssa (cTRPV3) on N (427). Kuten edellä on osoitettu, H-N-substituutio 426-jäämässä nisäkäs- tai sammakkoeläinlajeissa häiritsee asianmukaisia 2-APB-vasteita (kuva 2A). Johdonmukaisesti tämän jäännöksen ollessa tärkeä 2-APB-vasteiden kannalta 2-APB:n EC50 cTRPV3:ssa on 146,8 ± 3,4 μM (nHill = 2,5) verrattuna hiiren TRPV3:n EC50:een, joka on 11,5 ± 3,5 μM (nHill = 1,1). Silmiinpistävää on, että N427:n mutaatio H:ksi siirsi 2-APB:n konsentraatiovastekäyrää merkittävästi vasemmalle (EC50 6,1 ± 0,9 μM, nHill = 2,3), kun taas kamferin EC50-arvo säilyi ennallaan (kuva 3A). Koko solun patch clamp -rekisteröinti vahvisti, että 2-APB-konsentraatiovastekäyrä oli voimakkaasti siirtynyt vasemmalle kanan TRPV3-N427H:ssa verrattuna villityypin cTRPV3:een sekä +100 että -100 mV:ssä (Kuva 3B). Yksikanavaiset nauhoitukset paljastivat kanavien avautumisten lähes 200-kertaisen lisääntymisen perustasoon verrattuna 25 μM 2-APB:llä cTRPV3-N427H:ta ilmentävien solujen (n = 7) sisäkkäisissä laastareissa, kun taas villiä tyyppiä cTRPV3:a ilmentävien HEK293-solujen sisäkkäisissä laastareissa (n = 5) ei havaittu merkittäviä muutoksia. Kuitenkin 6 mM kamferia lisäsi voimakkaasti yksittäisten kanavien avautumisia HEK293-solujen sisäpuolisissa laastareissa, jotka oli transfektoitu joko villityyppisellä cTRPV3:lla tai cTRPV3-N427H-mutantilla, samankaltaisilla tasoilla (Kuva 3 C-E). Näin ollen yksittäinen pistemutaatio kanan TRPV3:ssa lisää spesifisesti sen herkkyyttä 2-APB:lle.