- Abstract
- 1. Johdanto
- 2. Materiaalit ja menetelmät
- 2.1. Tutkimusmenetelmät. Koehenkilöt
- 2.2. Verinäytteenotto
- 2.3. Perifeerisen veren mononukleaarisolujen (PBMC:t)
- 2.4. Fysiologinen analyysi. RNA:n uutto ja cDNA-synteesi
- 2.5. Alukkeiden suunnittelu
- 2.6. Seerumin biokemiallisten tekijöiden arviointi
- 2.7. Analyysi ja tulosten tulkinta
- 3. Tulos
- 3.1. Tutkimusryhmät. qRT-PCR:n tulokset
- 3.2. Geenien ilmentymisen arviointi PBMC:ssä
- 4. Keskustelu
- Esintressiristiriita
- Kiitokset
Abstract
ABCA1- ja ABCG1-geenit koodaavat kolesterolikuljettajaproteiineja, jotka ovat keskeisessä roolissa kolesterolin ja fosfolipidien homeostaasissa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida ja vertailla ABCA1- ja ABCG1-geenien ilmentymistä metabolisen oireyhtymän potilailla ja terveillä henkilöillä. Tämä tapaus-verrokkitutkimus tehtiin 36 potilaalle, joilla oli metabolinen oireyhtymä, ja samalle määrälle terveitä henkilöitä Hamadanissa (Iranin länsiosassa) vuosina 2013-2014. Kokonais-RNA uutettiin mononukleaarisista soluista ja puhdistettiin RNeasy Mini Kit -kolonnilla. ABCA1- ja ABCG1-geenien ilmentyminen suoritettiin qRT-PCR:llä. Lipidiprofiili ja paastoverensokeri mitattiin kolorimetrisin menetelmin. ABCG1:n ilmentyminen metabolisen oireyhtymän potilailla oli merkittävästi vähäisempää (noin 75 %) verrattuna kontrolliryhmään, kun taas ABCA1:n ilmentymisessä ei ollut merkittävää eroa kahden tutkitun ryhmän välillä. Muiden parametrien, kuten HDL-C:n, FBS:n, BMI:n, vyötärönympäryksen sekä systolisen ja diastolisen verenpaineen vertailu metabolista oireyhtymää sairastavien ja terveiden henkilöiden välillä osoitti merkittäviä eroja (). ABCG1:n ilmentymisen väheneminen metabolisen oireyhtymän potilailla verrattuna terveisiin henkilöihin viittaa siihen, että hyperglykemia, siihen liittyvät aineenvaihduntatuotteet ja hyperlipidemia yli kuljettajakapasiteetin johtivat ABCG1:n ilmentymisen vähenemiseen. Merkittävän muutoksen puuttuminen ABCA1-geenin ilmentymisessä kahden ryhmän välillä voi viitata ABCA1-ekspression erilaiseen säätelymekanismiin.
1. Johdanto
Metabolinen oireyhtymä (MetS) määritellään diabeteksen ja sydän- ja verisuonitautien (CVD) toisiinsa liittyvien riskitekijöiden kokonaisuudeksi . Metabolisen oireyhtymän kliiniseen diagnoosiin on joitakin kriteerejä, joihin kuuluvat kohonnut vyötärönympärys (≥102 cm miehillä ja ≥88 cm naisilla), kohonneet triglyseridit (≥150 mg/dl tai 1.7 mmol/l), alentunut suuren tiheyden lipoproteiinikolesteroli (HDL-C <40 mg/dl tai 1,03 mmol/l miehillä ja <50 mg/dl tai 1,3 mmol/l naisilla) ja kohonnut verenpaine (≥130 mmHg systolinen verenpaine tai ≥85 mmHg diastolinen verenpaine) . MetS voidaan diagnosoida havainnoimalla kolmea näistä kriteereistä. Viime vuosina MetS:n esiintyvyys on lisääntynyt maailmanlaajuisesti ; Yhdysvalloissa se on kuitenkin laskenut 25,5 prosentista (1999/2000) 22,9 prosenttiin (2009/2010). Weiss ja kollegat raportoivat, että lihavuus liittyy suoraan MetS:n lisääntyneeseen esiintyvyyteen . CVD:n ja plasman HDL-C-tason, joka on yksi metabolisen oireyhtymän kriteereistä, välillä on käänteinen yhteys . Suuritiheyksisellä lipoproteiinilla, joka on verenkierron lipoproteiinien alifraktio, on tärkeä rooli kolesterolin kuljetuksessa perifeerisestä kudoksesta maksasoluihin . HDL:ssä on runsaasti Apo A-I- ja Apo A-II -proteiineja, ja yli kaksi kolmasosaa sen sisällöstä on Apo A-I:tä .
ABC-transmembraanikuljettajilla on tärkeä rooli kolesterolin ottamisessa makrofagista HDL:ään ja vaahtosolujen muodostumisen vähentämisessä . ABCA1 koostuu 2261 aminohaposta ja esiintyy useimmissa kudoksissa. Viime vuosina on osoitettu, että ABCA1:llä on olennainen rooli sydän- ja verisuonitaudeilta suojautumisessa . HDL-synteesi riippuu suoraan ABCA1:n aktiivisuudesta maksasoluissa; toisin sanoen sillä on keskeinen tehtävä valtimosolujen suojaamisessa vaahtosoluilta lisäämällä plasman HDL:ää. Arteriaalisten makrofagien ABCA1-aktiivisuus on osoittanut käänteistä yhteyttä vaahtosolujen muodostumiseen, sillä sen aktiivisuuden lisääntyessä vaahtosolujen muodostuminen vähenee .
Vähentynyt tai heikentynyt ABCA1-aktiivisuus voi aiheuttaa eräitä sairauksia, kuten tyypin 2 diabetesta , Tangerin tautia ja ennenaikaista CVD:tä .
ABCG1-geeni sijaitsee kromosomissa 21q22.3 . Sekä ABCA1 että ABCG1 johtavat kudoskolesterolin vähenemiseen sen effluksoimalla HDL:ään, mutta ABCG1 kuljettaa kudoskolesterolia HDL2:een ja HDL3:een ja ABCA1 kuljettaa sitä lipidittömään Apo A-I:een . Makrofagit ovat ABCA1:n ja ABCG1:n toiminnan kannalta tärkein kudos . Monissa tutkimuksissa on tutkittu näiden geenien ylös- ja alasregulaation vaikutuksia.
Vähentynyt kolesterolin ulosvirtaus on seurausta ABCA1:n puutteellisesta ilmentymisestä in vitro ; se voi johtaa ateroskleroosin lisääntymiseen , mutta ABCA1:n ylösregulaatio johtaa ateroskleroosin vähenemiseen . ABCG1:n alasregulaatiolla on myös samat vaikutukset kolesterolin effluxiin, mutta ABCG1:n alasregulaation vaikutuksesta ateroskleroosiin on ristiriitaisia tuloksia .
MetS:ssä joidenkin geenien ilmentymismallit muuttuvat, ja ne voivat johtaa liikalihavuuteen, diabetekseen ja verenpaineeseen. Tässä tutkimuksessa pyrimme arvioimaan ABCA1- ja ABCG1-geenien ilmentymistä MetS:ää sairastavilla potilailla, koska nämä geenit osallistuvat kuljetinsynteesiin, joilla on ratkaiseva rooli kolesterolin kuljetuksessa.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1. Tutkimusmenetelmät. Koehenkilöt
Tämä tapaus-verrokkitutkimus tehtiin potilaille, jotka ohjattiin Hamadanin (Iranin länsiosa) sairaalan endokrinologiselle osastolle vuosina 2013-2014. Tutkimukseen valittiin 36 potilasta, joilla oli metabolinen oireyhtymä. Myös 36 iältään ja sukupuoleltaan vastaavaa tervettä henkilöä valittiin kontrolliryhmäksi. Yhdelläkään terveistä henkilöistä ei ollut metabolisen oireyhtymän kriteerejä.
Metabolisen oireyhtymän ryhmän sisäänottokriteerinä oli, että heillä oli kolme viidestä edellä mainitusta ominaisuudesta. Tutkimuksesta suljettiin pois potilaat, jotka olivat aiemmin käyttäneet rasva-, ehkäisy- ja diureettilääkkeitä. Raskaana olevat potilaat ja potilaat, joilla oli diabetes, tulehdus ja infektio, jätettiin myös pois.
2.2. Verinäytteenotto
Kunkin tutkittavan 2,5 ml:n verinäyte lisättiin EDTA:ta sisältävään putkeen ja säilytettiin 4 °C:ssa RNA:n uuttamista varten (korkeintaan kahden tunnin kuluttua).
2.3. Perifeerisen veren mononukleaarisolujen (PBMC:t)
Lymphodex (Saksa) ja Henx (Iran) -liuoksia käytettiin PBMC:n eristämiseen. Noin 2 ml Henx-liuosta lisättiin yhtä suureen määrään verta ja sekoitettiin kokonaan; sitten se kaadettiin 3 ml:aan Lymphodex-liuosta varovasti ja hitaasti. Tämän jälkeen seos asetettiin Lymphodexiin ja sitä sentrifugoitiin 1000 g:n nopeudella 20 minuutin ajan. Plasman ja Lymphodexin välinen valkoinen välikerros eristettiin mononukleaarisiksi soluiksi (MC); sitten Henxin puskuria lisättiin MC:hen, sekoitettiin täysin ja sentrifugoitiin. Lopuksi supernatantti hävitettiin ja prosessi toistettiin vielä kerran.
2.4. Fysiologinen analyysi. RNA:n uutto ja cDNA-synteesi
RNA:n nettouutto suoritettiin käyttämällä Gene JET RNA Purification kit -pakettia valmistajan protokollan mukaisesti. Puhdistetun RNA:n laatu ja määrä analysoitiin NanoSpectrophotometerillä (Epoch, BioTek, USA); sitten kunkin RNA-näytteen eheys tutkittiin käyttämällä 1 % agaroosigeeliä, 1x TBE.
RNA muunnettiin cDNA:ksi käyttämällä RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) -pakettia noudattamalla seuraavaa protokollaa: vaihe 1: alukkeen hehkutus 25 °C:ssa 5 minuutin ajan; vaihe 2: cDNA-synteesi 42 °C:ssa 60 minuutin ajan; vaihe 3: lämpöinaktivointi 70 °C:ssa 5 minuutin ajan. Tuotteet säilytettiin -80 °C:ssa seuraavia vaiheita varten.
2.5. Alukkeiden suunnittelu
Kunkin geenin spesifiset alukkeet suunniteltiin Allele ID -ohjelmistolla (versio 7.6). Reaaliaikaisen PCR-reaktion spesifisyyden lisäämiseksi ja väärien positiivisten tulosten vähentämiseksi yksi kunkin parin alukkeista suunniteltiin kiinnitettäväksi eksonien ja eksonien risteysalueelle. Kullekin geenille käytettyjen alukkeiden perusteelliset kriteerit esitetään taulukossa 1. Sisäisenä kontrollina käytettiin 18S rRNA:n taltiointigeeniä.
|
Geenien suhteellinen ilmentyminen laskettiin mittaamalla kynnyssyklin (CT) arvo kullekin näytteelle käyttäen C1000 termosykleriä ja CFX96 reaaliaikajärjestelmää (Bio-Rad, USA) ja SYBR Premix Ex Taq 2 Kit (TakaRa nro RR820L). CT-arvoksi määritettiin kunkin näytteen kolminkertaisen määrityksen CT:n keskiarvo. qRT-PCR-reaktion ainesosamäärät sisälsivät 10 μl SYBR-vihreää, 7 μl deionisoitua vettä ja 1 μl kutakin eteenpäin suuntautuvaa aluketta, käänteistä aluketta ja templaattia. qRT-PCR suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: alkuaktivointi 95 °C:ssa 30 sekunnin ajan ja sen jälkeen 40 sykliä, joissa toistettiin seuraavat vaiheet: denaturointi 95 °C:ssa 5 sekunnin ajan, hehkutus optimoidussa hehkutuslämpötilassa kunkin geenin oikean keston ajan ja pidennys 72 °C:ssa 30 sekunnin ajan, ja lopuksi tiedot hankittiin nostamalla lämpötilaa 72 °C:sta 95 °C:een 0,5 °C/0,05 sekunnin ajan. Tämän jälkeen PCR-tuotteet elektroforeerattiin (1 % agaroosigeelillä, 1x TBE) amplikonien spesifisyyden varmistamiseksi.
2.6. Seerumin biokemiallisten tekijöiden arviointi
Kustakin koehenkilöstä kerättiin kahden millilitran verinäyte ja seerumin erottelua varten se sentrifugoitiin 3000 rpm:ssä 10 minuutin ajan. Kokonaiskolesteroli (TC), LDL-C, TG, FBS ja HDL-C tutkittiin Hitachi 911:n (Saksa) Pars Azmun (Iran) kitillä.
2.7. Analyysi ja tulosten tulkinta
kaavaa käytettiin metabolisen oireyhtymän ja kontrolliryhmien suhteellisen geeniekspression analysointiin. Reaaliaikaisen PCR:n tehokkuus laskettiin kullekin geenille käyttämällä 10-2-laimennosta; sen jälkeen saatu luku sijoitettiin seuraavaan laskentakaavaan geeniekspression kertaisten muutosten mittaamiseksi :SPSS V.16 -ohjelmistoa käytettiin tilastolliseen analyysiin 95 prosentin luottamusväleillä. Muuttujien normaalijakauma tarkistettiin Kolmogorov-Smirnov-menetelmällä, minkä jälkeen arvoja verrattiin kahden ryhmän välillä riippumattomien otosten -testillä.
3. Tulos
Taulukossa 2 on esitetty tutkittujen ryhmien demografiset ominaisuudet ja biokemialliset tekijät. Miesten ja naisten suhde oli 1/3 kummassakin ryhmässä (12 M ja 24 F). Kuten taulukosta 2 käy ilmi, erot kaikissa tutkituissa parametreissa olivat tilastollisesti merkitseviä kahden ryhmän välillä () lukuun ottamatta ikää ja LDL-C:tä. Metabolisen oireyhtymän ryhmässä oli korkeampi BMI, LDL-C, TC, TG, FBS, diastolinen/diastolinen verenpaine ja vyötärönympärys verrattuna terveisiin henkilöihin, kun taas HDL-C oli metabolisen oireyhtymän ryhmässä merkitsevästi alhaisempi.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BMI: painoindeksi, FBS: paastoverensokeri, TG: triglyseridi, HDL-C: suuritiheyksinen lipoproteiinikolesteroli, LDL-C: pienitiheyksinen lipoproteiinikolesteroli; merkitsevä ero. |
3.1. Tutkimusryhmät. qRT-PCR:n tulokset
PCR-reaktion valmistumisen jälkeen tulokset tarkistettiin analysoimalla reaktiokäyrä, tuotteiden sulamiskäyrä ja PCR-tuotteiden elektroforeesi. Elektroforeesi ajettiin 1-prosenttisella agaroosilla käyttäen 100 bp:n DNA-tikapuita. Tulokset esitetään kuvassa 1.
3.2. Geenien ilmentymisen arviointi PBMC:ssä
Geenien ilmentymistasot mitattiin perifeerisen veren mononukleaarisoluista ja niitä verrattiin kahden ryhmän välillä laskemalla kunkin geenin ΔCT. ABCA1:n ilmentymisessä ei ollut eroa kahden ryhmän välillä, mutta ABCG1:n ilmentyminen oli merkittävästi vähäisempää MetS-ryhmässä (). Yksityiskohtaiset tulokset esitetään taulukossa 3.
|
||||||||||||||||||||||||||
Merkitt. |
Sekä ABCG1-geenin ilmentymisen kertaisen muutoksen laskeminen () osoitti, että ilmentyminen oli MetS-ryhmässä 3,1-kertainen.
4. Keskustelu
ABCA1:llä ja ABCG1:llä on ratkaiseva rooli kolesterolin käänteiskuljetuksessa perifeerisistä kudoksista, kuten makrofageista, maksaan . ABCA1- ja ABCG1-geenien ilmentymistä on kuitenkin tutkittu joissakin sairauksissa; emme löytäneet yhtään raporttia tästä aiheesta metabolisen oireyhtymän yhteydessä. Tässä tutkimuksessa tarkastelimme näiden geenien ilmentymistä metabolisen oireyhtymän koehenkilöillä ja terveillä henkilöillä.
Vaikka ABCA1-geenin ilmentymisessä ei ollut merkittävää eroa kahden tutkittavan ryhmän välillä, havaitsimme merkittävästi alhaisemman ABCG1-geenin ilmentymisen (noin 75 %) metabolista oireyhtymää sairastavilla koehenkilöillä kontrolliryhmään verrattuna. Singaraja ym. osoittivat, että vähentynyt ABCA1 makrofageissa ja munuaisissa liittyy lisääntyneeseen kolesterolipitoisuuteen . He päättelivät, että heikentynyt ABCA1-välitteinen kolesterolin vienti voi osaltaan vaikuttaa diabetekseen liittyvään lisääntyneeseen ateroskleroosiin ja nefropatiaan . Joissakin raporteissa on pyritty käsittelemään mahdollisia mekanismeja, jotka säätelevät näiden geenien ilmentymistä. Äskettäin on osoitettu, että ABCA1:n ja ABCC8:n polymorfismit voivat liittyä metaboliseen oireyhtymään . On näyttöä siitä, että ABCA1:n toiminnan häiriö, joka voi johtua tämän geenin mutaatiosta, voi johtaa familiaaliseen hypoalfaalipoproteinemiaan, jolle on ominaista alhainen HDL-arvo ja lisääntynyt kolesteryyliestereiden kertyminen useissa kudoksissa ja soluissa . Lisäksi on osoitettu, että ABCA1-geenin yliekspressio voi antaa suojan ateroskleroosia vastaan . Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia havaintojemme kanssa ja tukevat tätä ajatusta, että ABCA1-geenin alhaisempi ilmentyminen voi edistää metabolisen oireyhtymän komplikaatioita.
Haghpassand et al. osoittivat, että ABCA1-geenin ilmentymisellä PBMC:ssä on suora yhteys kolesterolikuormitukseen, ja ABCA1:n yliekspressio johtaa ylimääräisen kolesterolin siirtymiseen apoproteiineihin . Wang ym. tutkivat käänteistä kolesterolikuljetusta ABCA1- ja ABCG1- tyrmäyshiirissä ja totesivat, että kun sekä ABCA1 että ABCG1 tyrmättiin, käänteinen kolesterolikuljetus on suurempaa kuin ABCG1:n tyrmätessä .
Sen jälkeen, kun Mauerer ym. huomauttivat, että korkea glukoositaso (hyperglykemia) on osallisena vähentyneeseen ABCA1- ja ABCG1- ekspressioon in vitro , vaikuttaa loogiselta odottaa samanlaisia muutoksia MetS:ssä. ABCA1:n ja ABCG1:n promoottoreilla on reseptoripaikka LXR:lle ja RXR:lle; kun oksikolesteroli ja retinohappo liittyvät näihin tekijöihin, ABCA1:n ja ABCG1:n ilmentyminen lisääntyy. Myös cAMP ja NFκB ovat ABCA1:n ja ABCG1:n transkriptiotekijöitä.
Saadut tulokset osoittivat ABCG1:n ilmentymisen merkittävää vähenemistä metabolisen oireyhtymän potilailla verrattuna terveisiin henkilöihin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että hyperglykemia, siihen liittyvät aineenvaihduntatuotteet ja hyperlipidemia yli kuljettajakapasiteetin voivat johtaa ABCG1:n vähentyneeseen ilmentymiseen. Koska ABCA1-geenin ilmentymisessä ei havaittu merkittävää muutosta, se voi johtua erilaisesta säätelymekanismista. Koska näiden geenien rakenteet ovat erilaisia ja niitä säätelevät erilaiset transkriptiotekijät, tuloksemme voidaan perustella . Näytteiden rajallinen määrä tässä tutkimuksessa on kuitenkin toinen tekijä, joka selittää ABCA1:n ilmentymisen muutosten puuttumisen.
Toinen seikka on se, että tutkimme näiden geenien ilmentymistä tutkittujen henkilöiden PBMC:ssä; on tärkeää huomata, että näiden geenien ilmentymisen muutokset monosyyteissä voivat poiketa muutoksista muissa keskeisissä kudoksissa, kuten maksassa ja suolistossa, jotka ovat HDL:n synteesin tärkeimpiä paikkoja. Lisäksi muutokset mRNA-tasoissa eivät välttämättä tarkoita muutoksia niihin liittyvissä proteiineissa.
Esintressiristiriita
Tekijät ilmoittavat, että eturistiriitoja ei ole.
Kiitokset
Tämä artikkeli on poimittu Zahra Tavoosin maisterintutkielmasta. Kirjoittajat haluavat kiittää Hamadanin lääketieteellisen tiedekunnan yliopistoa tämän tutkimuksen taloudellisesta tukemisesta.