Vaikka proteiinimäärityksillä on monenlaisia käyttötarkoituksia biotieteellisessä tutkimuksessa, ei ole olemassa yhtä ainoaa määritysmenetelmää, joka soveltuu kaikkiin sovelluksiin. Kaikesta nykyaikaisen tieteen kehityksestä huolimatta ei ole olemassa sellaista proteiinimääritysmenetelmää, johon eivät vaikuta muut kuin proteiinikomponentit tai proteiinikoostumuksen erot. Tästä syystä proteiinilaboratoriot pitävät tarpeellisena useampaa kuin yhtä proteiinimääritystyyppiä tutkimussovelluksia varten.
Kullakin määrityksellä on omat etunsa ja rajoituksensa. Näin ollen, jos haluat saada tarkkoja tuloksia kokeestasi, sinun on osattava valita sovellukseesi sopivin määritysmenetelmä.
Kolorimetristen proteiinimääritysten tyypit
Käytettävän kemian perusteella kaksi yleisintä menetelmää kokonaisproteiinin kolorimetriseen havaitsemiseen ja kvantifiointiin ovat proteiinien väriaineita sitova määritysmenetelmä (protein-dye binding assay) ja/tai kupari-ioniin pohjautuva kelaatioanalyysi.
Väriaineen sitoutumismääritykset
Väriaineen sitoutumismääritykset, kuten Bradfordin (Coomassie) ja 660 nm:n proteiinimääritykset, perustuvat proteiinimolekyylien sitoutumiseen Coomassie-väriaineeseen happamissa olosuhteissa. Kun proteiinimolekyylit sitoutuvat väriaineeseen, väri muuttuu ruskeasta (Amax = 465 nm) siniseksi (Amax = 610 nm). Väritiheyden muutos (joka luetaan 595 nm:ssä) on verrannollinen proteiinikonsentraatioon.
Emäksisillä aminohapoilla (arginiini, lysiini ja histidiini) on tärkeä rooli väriaine-proteiinikompleksien muodostumisessa ja siitä johtuvassa spektrisiirtymässä, kun taas pienemmät proteiinit (alle 3 kDa) ja aminohapot eivät aiheuta värimuutoksia.
Kupari-ionipohjaiset määritykset
Kupari-ionipohjaisissa proteiinimäärityksissä proteiiniliuos sekoitetaan emäksisen kuparisuolaliuoksen kanssa kupari-ionien (Cu2+) kelaatin muodostumisen helpottamiseksi peptidisidosten kanssa ja sitä seuraavan kupari-ionien (Cu2+) pelkistymisen helpottamiseksi kupari-ioneiksi (Cu+). Mahdolliset ylimääräiset kupari-ionit jäävät sitoutumatta peptidisidoksiin ja ovat käytettävissä havaitsemista varten.
Kupari-ioneihin perustuvat proteiinimääritykset voidaan jakaa kahteen ryhmään – (1) määritykset, jotka havaitsevat pelkistyneet kupari-ionit (Cu+), ja (2) määritykset, jotka havaitsevat sitoutumattomat kupari-(Cu2+)ionit. Kupari-ionien havaitsemiseen voidaan käyttää bikinikoniinihappoa (BCA) tai Folin-reagenssia (fosfomolybdeeni-/fosfotungstiinihappo). Käytetyn reagenssin pelkistyessä syntyy sininen väri. Tuotetun värin määrä voidaan lukea 650 nm:n ja 750 nm:n välillä, ja se on verrannollinen peptidisidosten määrään.
Huomautus: Tyrosiinin, tryptofaanin, kysteiinin, histidiinin ja asparginiinin esiintyminen proteiineissa lisää syntyvää väritiheyttä.
Sitoutumattomien kupari-ionien havaitsemiseen perustuvissa määrityksissä emäksinen kupari sekoitetaan proteiiniliuokseen, minkä jälkeen sitoutumattomat kupari-ionit havaitaan väriä tuottavalla reagenssilla, joka reagoi kupari-ionien kanssa. Tuotetun värin määrä on kääntäen verrannollinen näytteessä olevan peptidisidoksen määrään.
Proteiinimääritysten valinta: Some Factors to Consider
On olemassa useita tekijöitä, jotka sinun tulisi ottaa huomioon, kun valitset määritystä. Seuraavassa on joitakin niistä.
- Yhteensopivuus näytetyypin ja komponenttien kanssa. Proteiininäytteen luonne ja muiden kuin proteiinien sisältämien aineiden esiintyminen proteiiniliuoksissa voi vaikuttaa merkittävästi kokeen tuloksiin. Pidä mielessä, että pelkistävien aineiden, metallikelatointiaineiden, väriaineiden, amiinien ja sokerien läsnäolo häiritsee kuparipohjaisia proteiinimäärityksiä, kun taas detergenttejä sisältävät proteiiniliuokset häiritsevät väriainepohjaisia proteiinimäärityksiä.
- Määritysalue ja tarvittava näytemäärä. Useimmat kolorimetriset määritykset vaativat vähintään 0,5 µg proteiineja luotettavan arvioinnin saamiseksi. Näin ollen vaikeasti saatavien näytteiden osalta olisi harkittava menetelmiä, jotka vaativat mahdollisimman vähän näytemäärää luotettavan arvion saamiseksi.
- Proteiinien välinen yhdenmukaisuus. Väriaineisiin perustuvissa proteiinimäärityksissä ja määrityksissä, joissa kupari-ionit pelkistyvät kupari-ioneiksi, on merkittävää proteiinien välistä vaihtelua.
- Ajalliset näkökohdat. Näytteen monimutkaisuus ja valittu määritysmenetelmä määräävät proteiinimäärityksen suorittamiseen tarvittavan ajan. Häiriötekijöitä sisältävät proteiininäytteet ja määritykset, joissa käytetään standardikuvauksia tai -käyriä, vievät enemmän aikaa.
- Laitteistovaatimukset. Myös määrityksen tuottaman värin (absorbanssin) mittaamiseen tarvittavan spektrofotometrin tai levylukijan saatavuus voi vaikuttaa valintaasi.
