Objektiivi kerää viuhkan säteitä jokaisesta objektin pisteestä ja kuvaa sädekimppua okulaarin etummaiseen polttotasoon. Kuvanmuodostukseen sovelletaan tavanomaisia säteiden jäljittämisen sääntöjä. Aberraation puuttuessa geometriset säteet muodostavat pistemäisen kuvan kustakin kohdepisteestä. Aberraatioiden esiintyessä kutakin kohdepistettä kuvaa epämääräinen piste. Okulaari on suunniteltu kuvaamaan säteet polttopisteeseen, joka on sopivalla etäisyydellä kuvan tarkastelua varten. Tässä järjestelmässä kuvan kirkkaus määräytyy linssien aukkojen koon ja silmän pupillin aukon mukaan. Objektiivin polttoväli ja siitä johtuva suurennos on valittava siten, että saavutetaan haluttu kohteen erottelukyky okulaarin läpi katselua varten sopivassa koossa. Kuvanmuodostusta mikroskoopissa vaikeuttaa kuvantamisjärjestelmässä tapahtuva diffraktio ja interferenssi sekä vaatimus käyttää valonlähdettä, joka kuvataan polttotasossa.
Encyclopædia Britannica, Inc.
Nykyaikaisen teorian kuvanmuodostuksesta mikroskoopissa perusti saksalainen fyysikko Ernst Abbe vuonna 1873. Abben teorian lähtökohtana on, että mikroskoopin polttotasossa olevat kohteet valaistaan lauhduttimesta tulevalla konvergentilla valolla. Lähteestä lähtevää konvergenssivaloa voidaan pitää useiden tasoaaltojen kokoelmana, jotka etenevät tiettyihin suuntiin ja asettuvat päällekkäin muodostaen valaistuksen. Jokainen näistä tehokkaista tasoaalloista taittuu kohteen tasossa olevista yksityiskohdista: mitä pienempi kohteen yksityiskohtainen rakenne on, sitä suurempi on diffraktiokulma.
Kohteen rakenne voidaan esittää sinimuotoisten komponenttien summana. Komponenttien tilassa tapahtuvan vaihtelun nopeus määritellään kunkin komponentin jaksolla eli sinimuotoisen funktion vierekkäisten huippujen välisellä etäisyydellä. Paikkataajuus on jakson käänteisluku. Mitä hienommat yksityiskohdat ovat, sitä korkeampi on kohteen yksityiskohtia edustavien komponenttien vaadittu paikkataajuus. Kukin paikkataajuuskomponentti aiheuttaa diffraktiota tietyssä kulmassa, joka riippuu valon aallonpituudesta. Esimerkiksi paikkataajuuskomponenttien, joiden jakso on 1 μm, paikkataajuus on 1 000 viivaa millimetrillä. Tällaisen komponentin diffraktiokulma näkyvälle valolle, jonka aallonpituus on 550 nanometriä (nm; 1 nanometri on 10-9 metriä), on 33,6°. Mikroskoopin objektiivi kerää nämä diffraktoituneet aallot ja ohjaa ne kuvatasolle, jossa diffraktoituneiden aaltojen interferenssi tuottaa kuvan kohteesta.
Koska objektiivin aukko on rajallinen, kaikki kohteen diffraktoituneet aallot eivät pääse objektiivin läpi. Abbe osoitti, että mitä suurempi määrä diffraktoituneita aaltoja pääsee objektiiviin, sitä hienommat yksityiskohdat kuvasta voidaan rekonstruoida. Hän käytti termiä numeerinen aukko (N.A.) mittaamaan objektiivin kykyä kerätä taittunutta valoa ja siten myös sen kykyä ratkaista yksityiskohtia. Tämän perusteella on selvää, että mitä suurempi objektiivin suurennos on, sitä suurempi on objektiivin vaadittu N.A.. Suurin teoreettisesti mahdollinen N.A. ilmassa on 1,0, mutta optisen suunnittelun rajoitukset rajoittavat saavutettavan N.A.:n noin 0,95:een kuivissa objektiiveissa.
Yllä olevassa esimerkissä, jossa näytteen spatiaalinen taajuus on 1 000 viivaa millimetrillä, tarvittavan N.A.:n suuruus taittuneen valon keräämiseksi olisi 0,55. Näin ollen on käytettävä vähintään 0,55 N.A.:n objektiivia, jotta voidaan havainnoida ja kerätä käyttökelpoista tietoa kohteesta, jonka yksityiskohdat ovat 1 μm:n etäisyydellä toisistaan. Jos objektiivin N.A. on pienempi, kohteen yksityiskohtia ei saada erotettua. Jos kuvan yksityiskohtia yritetään suurentaa suuritehoisella okulaarilla, erotuskyky ei lisäänny. Tätä jälkimmäistä tilaa kutsutaan tyhjäksi suurennokseksi.
Valon aallonpituus lyhenee, kun se etenee tiheässä väliaineessa. Mahdollisimman pienten yksityiskohtien erottamiseksi upotusobjektiivit pystyvät keräämään hienompien yksityiskohtien taittamaa valoa kuin ilmassa olevat objektiivit. N.A. kerrotaan väliaineen taitekertoimella, ja työ-N.A.:n arvot 1,4 ovat mahdollisia. Parhaissa optisissa mikroskoopeissa voidaan havaita rakenteita, joiden tilataajuus on jopa 0,4 μm. Huomattakoon, että Leeuwenhoekin valmistamien yksittäisten linssien on osoitettu kykenevän erottamaan vain 0,7 μm paksuja fibrillejä.