Koska proteiinien tarkka kvantitatiivinen määritys on olennaista kaikissa proteiinitutkimuksiin liittyvissä kokeissa, on kehitetty erilaisia menetelmiä, joilla voidaan mitata proteiinien pitoisuutta tietyssä määrityksessä. Joitakin perinteisempiä kokonaisproteiinien kvantifiointimenetelmiä ovat UV-absorbanssin mittaaminen 280 nm:ssä (A280), bikinikoniinihappo- (BCA) ja Bradford-määritykset sekä muut vaihtoehtoiset menetelmät, kuten Lowryn ja muut uudenlaiset määritykset.
Koska proteiinit absorboivat valoa tietyllä aallonpituudella, mittaus voidaan suorittaa spektrofotometrin avulla. Erityisesti aminohapoilla tyrosiinilla ja tryptofaanilla on hyvin spesifinen absorptio 280 nm:ssä, mikä mahdollistaa proteiinikonsentraation suoran A280-mittauksen.
UV-absorbanssia 280 nm:ssä käytetään rutiininomaisesti proteiinikonsentraation arvioimiseen laboratorioissa yksinkertaisuutensa, helppokäyttöisyytensä ja edullisuutensa vuoksi. Mittaukset ovat nopeita ja hyvin toistettavia, koska inkubointia ei tarvita. Lisäksi tämä menetelmä vaatii erittäin pienen näytemäärän, koska nykyaikaisissa spektrofotometreissä käytetään näytteen pidätysjärjestelmää mittauksen aikana.
On kuitenkin huolehdittava siitä, että proteiininäyte ei sisällä muita kuin proteiinikomponentteja (esim. nukleiinihappoja), joilla on sama absorptiospektri, koska se voi johtaa virheellisiin tuloksiin. Proteiinipitoisuuksien määrittämisen lisäksi absorbanssiarvoja voidaan käyttää myös konformaatiomuutosten ja ligandien sitoutumisen havaitsemiseen sekä entsyymireaktioiden seuraamiseen.
Tryptofaanin ja tyrosiinin vaikutus proteiinien kvantifioinnissa
Tyrosiinin ja tryptofaanin läsnäolosta johtuen näitä aromaattisia aminohappoja sisältävät proteiinit ja peptidit absorboivat ultraviolettisäteilyn valoa aallonpituudella 280 nm. Kullakin näistä jäämistä on omat absorptio- ja emissioaallonpituutensa, ja niiden kvanttituotot vaihtelevat. Fenyylialaniini ja disulfidisidokset vaikuttavat myös absorptioon tällä aallonpituudella, mutta koska se on suhteellisen merkityksetöntä, se voidaan havaita vain, jos sekä tryptofaania että tyrosiinia ei ole.
Monet aromaattisia rengasrakenteita sisältävät entsymaattiset kofaktorit (esim. FMN, FAD, NAD ja porfyriinit) absorboivat niin ikään UV-valoa herätessään ja lisäävät näin ollen tuloksena olevan fluoresenssin voimakkuutta. Erikoisproteiineissa, kuten vihreässä fluoresoivassa proteiinissa, on myös sisäinen serinetyrosiini-glysiinisekvenssi, joka on muunnettu translaation jälkeen ja fluoresoi näkyvän valon alueella.
Tryptofaani
Tryptofaani fluoresoi huomattavasti enemmän kuin tyrosiini ja fenyylialaniini. Sen fluoresenssiominaisuudet ovat kuitenkin liuottimesta riippuvaisia, eli spektri siirtyy lyhyemmille aallonpituuksille ja sen intensiteetti kasvaa liuottimen poolisuuden vähentyessä. Näin ollen taitettujen proteiinien hydrofobisiin domeeneihin hautautuneilla tryptofaanijäännöksillä on 10-20 nm:n spektrinen siirtymä.
Johtuen sen suuremmasta absorptiokyvystä, suuremmasta kvanttituottokyvystä ja resonanssienergiansiirrosta, näitä kolmea aminohappoa sisältävän proteiinin fluoresenssispektri muistuttaa yleensä tryptofaanin spektriä.
Tyrosiini
Tyrosiini voi virittyä samanlaisilla aallonpituuksilla kuin tryptofaani, mutta emittoi selvästi eri aallonpituudella. Vaikka voikin olla totta, että tyrosiini on vähemmän fluoresoiva kuin tryptofaani, se voi antaa merkittävän signaalin, koska sitä esiintyy usein suuria määriä monissa proteiineissa. Tyrosiinin fluoresenssin on havaittu vaimenevan läheisten tryptofaaniryhmien läsnäollessa joko resonanssienergian siirron tai sen aromaattisen hydroksyyliryhmän ionisoitumisen kautta.
Tässä on joitakin tärkeitä seikkoja, jotka on syytä muistaa mitattaessa peptidejä A280-menetelmällä.
- Molekyylipainoltaan samankaltaisilla proteiineilla voi olla erilaiset absorbanssiarvot tryptofaani- ja tyrosiinipitoisuuksien eroista johtuen.
- UV-absorptioon vaikuttaa myös proteiinin rakenne. Näin ollen rakenteeseen vaikuttavat olosuhteet (kuten lämpötila, pH, ionivahvuus tai detergenttien läsnäolo) voivat vaikuttaa aromaattisten jäämien kykyyn absorboida valoa 280 nm:ssä ja muuttaa proteiinin ekstinktiokertoimen arvoa.
- Aromaattisten aminohappojen paikallisella ympäristöllä voi olla vaikutusta niiden spektriin. Tämä tarkoittaa, että tryptofaanilla on emissiopiikki matalammilla aallonpituuksilla, kun se on haudattuna proteiinin hydrofobisille sisäalueille, kun taas tyrosiini siirtää usein energiansa viereisiin tryptofaaniaminohappoihin. Ionisoitu tyrosinaatti, joka muodostuu, kun tyrosiinista menetetään protoneja pH:n nousun seurauksena, osoittaa samanlaisia aallonpituuksia kuin tryptofaani.