5-hydroxymethylcytosine en zijn mogelijke rol in ontwikkeling en kanker

Dubbele rol van 5-hydroxymethylcytosine als een stabiele DNA base en als een tussenproduct in DNA demethylering

We weten nu dat 5hmC niveaus aanzienlijk variëren tussen verschillende celtypes en weefsels en het hoogst zijn in de hersenen, in het bijzonder in neuronen . Omdat 5hmC een oxidatieproduct van 5mC is, is het duidelijk dat de vorming van 5hmC uit 5mC automatisch de niveaus van 5mC op een bepaalde nucleotidepositie of zelfs genoom-breed verlaagt. Daarom was het onmiddellijk duidelijk dat de omzetting van 5mC in 5hmC de eerste stap zou kunnen zijn in een route die naar DNA demethylering leidt. Er zijn aanwijzingen uit verschillende experimentele systemen dat dit inderdaad het geval kan zijn. Het eindresultaat van deze demethyleringsroute is passieve of actieve verwijdering van de gemodificeerde base en/of verdwijning van de methylgroep uit cytosine in DNA (figuur 1). Bij de passieve demethyleringsroute kan 5hmC niet worden gekopieerd door het onderhouds-DNA-methyltransferase, DNMT1, een enzym dat reeds bestaande methyleringspatronen vermeerdert en werkzaam is op gehomethyleerde CpG-sites . Het actieve demethyleringsproces dat 5hmC als tussenproduct gebruikt, is aanzienlijk gecompliceerder. Eén verslag suggereerde dat 5hmC kan worden omgezet in cytosine door DNA-methyltransferasen . Bij deaminatie van 5hmC ontstaat 5-hydroxymethyluracil , dat kan worden verwijderd door base-excisie reparatie-enzymen waaronder thymine DNA-glycosylase (TDG) en enkelstrengs selectief monofunctioneel uracil DNA-glycosylase (SMUG1) . Hoe doeltreffend een dergelijke route in vivo werkt, is momenteel echter onbekend. Stapsgewijze oxidatie van 5hmC door TET-eiwitten levert 5-formylcytosine (5fC) en vervolgens 5-carboxylcytosine (5caC) op. Dit 5caC, dat in lage concentraties in DNA aantoonbaar is, kan vervolgens worden verwijderd door base-excisie reparatie, gekatalyseerd door de DNA glycosylase activiteit van het eiwit TDG, of door decarboxylering. Theoretisch zou de decarboxyleringsroute gunstig moeten zijn, omdat hierbij geen breuk van de DNA-fosfodiësterbindingen nodig is, die wel optreedt bij door TDG geïnitieerd base-excisieherstel. Tot op heden is er echter geen enzymatische activiteit voor de decarboxyleringsstap geïdentificeerd, hoewel decarboxylering wel lijkt voor te komen.

In veel weefsels worden aanzienlijke hoeveelheden 5hmC geaccumuleerd, veel meer dan te verwachten zou zijn als deze base slechts een tijdelijk tussenproduct zou zijn in een sequentieel oxidatieproces dat leidt tot DNA-demethylering. Daarom kan 5hmC een epigenetische module zijn die zijn eigen unieke biochemische coderende eigenschappen heeft. Deze functie kan negatief of afstotend zijn, omdat oxidatie van de methylgroep tijdens de productie van 5hmC de binding blokkeert van eiwitten die anders met 5hmC zouden interageren. Anderzijds kan het een positieve of instructieve functie hebben als er eiwitten bestaan die zich specifiek aan 5hmC binden. Tot dusver hebben verschillende eiwitten aangetoond 5hmC te kunnen herkennen, althans in vitro, waaronder UHRF1 , MBD3 , MeCP2 , en verschillende andere die door een proteomics-benadering zijn geïdentificeerd. De biologische rol van hun binding aan 5hmC is echter nog niet geheel duidelijk. De meeste van deze eiwitten hebben ook andere functies, en zijn daarom misschien niet uniek ontworpen voor interactie met 5hmC.

De rol van 5-hydroxymethylcytosine in de ontwikkeling en differentiatie van zoogdieren

De functionele rol van 5hmC in de genomen van zoogdieren is nog onduidelijk. Aan het begin van de levenscyclus van zoogdieren, bij de bevruchting van oöcyten door sperma, wordt het grootste deel van de 5hmC in het vaderlijke (van sperma afkomstige) genoom geoxideerd tot 5hmC . Deze oxidatiestap, waarvan men vroeger dacht dat het een echte DNA ‘demethylering’ was, is specifiek voor het vaderlijke genoom, terwijl het moederlijke (van de eicel afkomstige) genoom beschermd blijft tegen oxidatie door Tet. De oxidatie van het vaderlijke genoom wordt gekatalyseerd door Tet3, dat wordt gecodeerd door het enige Tet-gen dat op substantiële niveaus tot expressie komt in oöcyten en zygoten. Genetische knock-out van Tet3 in muizen resulteert in mislukte vaderlijke genoom oxidatie, gecompromitteerde ontwikkeling en perinatale letaliteit.

Een andere belangrijke ontwikkelingsovergang betreft de globale DNA demethylering in primordiale kiemcellen (PGCs) die begint rond embryonale dag 8,5 tot 9,5 en wordt voltooid rond embryonale dag 13,5. De mechanismen van methyleringsverwijdering in PGC’s zijn grotendeels onduidelijk en controversieel gebleven. Lange tijd is aangenomen dat replicatie-onafhankelijke actieve DNA demethylering een belangrijke route is die waarschijnlijk bij deze stap betrokken is. Recentere gegevens wijzen echter op een passief verlies van methylering, veroorzaakt door een gebrek aan methyleringsbehoud tijdens DNA replicatie. Dit passieve verlies van 5mC kan effectief worden geïnitieerd door omzetting van 5mC in 5hmC . Tet1 en Tet2 zijn de 5mC oxidases die het meest tot expressie komen in PGCs in dit stadium . Nakomelingen van muizen deficiënt in Tet1 en Tet2 hebben tekortkomingen in DNA demethylatie bij ingeprente genen . Tet1/2-deficiënte dieren van beide geslachten waren echter vruchtbaar, waarbij de vrouwtjes kleinere eierstokken en verminderde vruchtbaarheid hadden. Verwijdering van Tet1 en Tet2 kan levensvatbare volwassenen produceren, hoewel de meerderheid van deze muizen sterft tijdens de embryogenese of rond de geboorte en verschillende ontwikkelingsdefecten vertoont. De gegevens suggereren dat Tet1/2-geïnduceerde 5mC-oxidatie in PGC’s niet absoluut noodzakelijk is voor het voortbrengen van levensvatbare nakomelingen. De momenteel beschikbare informatie over DNA demethylering in zygoten en in PGCs mist nog steeds een meer specifieke analyse van 5hmC op DNA-sequentie niveau, zoals kan worden bereikt, bijvoorbeeld, door TAB-sequencing . Verwacht wordt dat dergelijke informatie duidelijkheid zal verschaffen over de globale of locus-specifieke betrokkenheid van 5hmC-vorming bij de initiatie van passieve (of actieve) DNA-demethylering. De eerdere implicatie van base excision repair processen in kiembaan herprogrammering , die op zichzelf een enorm risico voor het behoud van genoom integriteit zou vormen indien werkzaam op een wereldwijd niveau, kan verschillende andere verklaringen hebben. In het ene scenario kan het optreden van basenexcisie herstelactiviteit verklaard worden door de noodzaak om ongewenste, niet-beoogde oxidatiereacties tegen te gaan die gekatalyseerd worden door Tet-oxidase activiteit op guanines op gemethyleerde CpG plaatsen (guanine is de DNA base die het meest gevoelig is voor oxidatie). In een andere setting kan 5hmC verder worden geoxideerd, misschien op specifieke sequenties, door Tet-eiwitten om 5caC te vormen, dat vervolgens wordt verwijderd door base-excisie reparatie geïnitieerd door TDG.

Omdat 5hmC het meest overvloedig aanwezig is in hersenweefsel, is het een prioriteit geworden om de functie van deze gemodificeerde base in de hersenen te begrijpen. Bijvoorbeeld, in DNA van menselijke hersenschors, het niveau van 5hmC is ongeveer 1% van alle cytosines of 20 tot 25% van alle 5mC basen . Dit komt overeen met ongeveer 6.000.000 5hmC basen per haploïd genoom. Het is duidelijk dat deze niveaus suggereren dat 5hmC een belangrijke functionele rol in de hersenen van zoogdieren vervult. Uit tot dusver gerapporteerde studies blijkt dat 5hmC in hersenweefsels zeer overvloedig aanwezig is binnen gengebieden, hetzij bij promotors, hetzij nog meer binnen intragene gebieden, de zogenaamde genlichamen. Het is denkbaar dat de vorming van 5hmC bij promotors, CpG eilanden of CpG eiland oevers (randen) analoog functioneert aan een reparatieproces om ongepaste geïntroduceerde 5hmCs in deze regio’s te oxideren en uiteindelijk te verwijderen . Afzetting van 5hmC in promotors of genlichamen correleert vaak positief met genactiviteit. Het mechanisme van hoe genlichaam-geassocieerde 5hmC transcript niveaus verhoogt is momenteel onbekend. Eén mogelijkheid is dat de oxidatie van 5hmC een repressief effect op de transcriptie heeft, misschien door het tegengaan van ongewenste intragene anti-sense transcriptie. Andere verklaringen kunnen zijn dat 5hmC een destabiliserend effect heeft op de DNA structuur, dat mogelijk het openen van de dubbele helix door het transcriptie apparaat bevordert.

5hmC, hoewel niet herkend door verschillende methyl-CpG bindende eiwitten, waaronder MBD1, MBD2 en MBD4 , is in staat om MeCP2 te binden, een methyl-CpG-bindend eiwit dat overvloedig aanwezig is in de hersenen en gemuteerd is in de neurologische aandoening Rett syndroom. Eerdere studies, die gebruik maakten van het methyl-CpG bindend domein (MBD) van MeCP2 in plaats van het volledige eiwit, kwamen niet tot de conclusie dat MeCP2 bindt aan 5hmC . De redenen voor deze discrepanties zijn niet duidelijk. Het verband tussen MeCP2 en 5hmC in de hersenen is van bijzonder belang omdat de niveaus van 5hmC het hoogst zijn in de hersenen en MeCP2 een overvloedig eiwit in de hersenen is dat niveaus bereikt die vergelijkbaar zijn met die van histon H1. Om deze redenen kan een genoom-brede in plaats van sequentie-specifieke mechanistische rol van 5hmC-binding door MeCP2 in de hersenen worden verwacht.

Zoals onlangs is aangetoond, is de vorming van 5hmC van cruciaal belang voor de ontwikkeling van de hersenen. De base is overvloedig aanwezig in zich ontwikkelende neuronen, waarin het niveau toeneemt ten opzichte van neurale progenitorcellen en waar het zich specifiek lokaliseert in genlichamen van genen die belangrijk zijn voor neuronale differentiatie. Tet3 komt het meest tot expressie in de zich ontwikkelende hersenschors van de muis, gevolgd door Tet2 en de niveaus van Tet1 zijn zeer laag in dit weefsel. Een toename van de niveaus van Tet2, Tet3 en 5hmC in differentiërende neuronen valt samen met een vermindering van het Polycomb H3K27-methyltransferase Ezh2 en verlies van H3K27me3 bij kritische genen. Verlaging van de niveaus van Tet2 en Tet3 of verhoging van Ezh2 expressie resulteert in onvolledige of geblokkeerde neuronale differentiatie. Dus, de vorming van 5hmC bevordert neuronale differentiatie door modulatie van de expressie van genen die het meest kritisch zijn in deze belangrijke ontwikkelingsovergang.

Verlies van 5-hydroxymethylcytosine in kanker

De niveaus van 5hmC in kanker zijn sterk verminderd ten opzichte van het overeenkomstige normale weefsel rondom de tumor . Met behulp van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie, anti-5hmC-antilichaam-gebaseerde immuno-dot blots en immunohistochemie, toonden we tumor-geassocieerd verlies van 5hmC aan voor kankers van de long, de hersenen, de borst, de lever, de nier, de prostaat, de darm, de baarmoeder en het melanoom . Andere onderzoekers bevestigden deze observatie door het aantonen van verlies van 5hmC in verschillende soorten solide tumoren. Bovendien is aangetoond dat herintroductie van TET2 de 5hmC niveaus herstelt en het metastatisch potentieel van melanoomcellen vermindert. Opvallend is dat wanneer we weefseldelen co-immunokleurden met antilichamen tegen 5hmC en tegen het Ki67 antigeen, dat een marker is die alleen gevonden wordt in prolifererende cellen, we waarnamen dat 5hmC en Ki67 bijna nooit gelijktijdig aanwezig zijn in een enkele cel. Op klinisch diagnostisch niveau zou de gecombineerde immunohistochemische analyse van 5hmC-verlies en de aanwezigheid van Ki67-positieve cellen kunnen worden ontwikkeld tot een biomarker voor de diagnose van kanker. Het ontbreken van, of sterke vermindering van, 5hmC in tumoren suggereert dat prolifererende cellen 5hmC verliezen. In de meeste gevallen is de bulk van de tumormassa verarmd van 5hmC, zelfs wanneer Ki67-positieve cellen zeldzaam zijn, wat suggereert dat deze tumorcellen een voorgeschiedenis van proliferatie hebben gehad die tot verlies van 5hmC heeft geleid, dat vervolgens niet opnieuw wordt hersteld. De replicatie-afhankelijke verlies van 5hmC weerspiegelt een situatie die doet denken aan die in preimplantatie embryo’s, waarin de initiële vorming van 5hmC in de vaderlijke DNA wordt gevolgd door replicatie-afhankelijk verlies of verdunning van deze markering . Evenzo neemt het totale 5hmC-gehalte snel af als cellen van normaal weefsel zich aanpassen aan celkweek. De eenvoudigste verklaring is dat oxidatie van 5mC een hemi-gehydroxymethyleerde CpG plaats in DNA produceert die niet door DNMT1 herkend wordt tijdens DNA replicatie. Een dergelijke verklaring is consistent met in vitro studies die aantonen dat DNMT1 niet in staat is om te werken op CpG sites die 5hmC bevatten. Andere verklaringen voor de vermindering van 5hmC in kanker zijn echter ook mogelijk. De niveaus van TET-eiwitten kunnen lager zijn in tumorweefsel dan in de overeenkomstige normale weefsel tegenhanger. Hoewel wij geen consistente verschillen op RNA-niveau voor TET1, TET2, of TET3 in long- en hersentumoren ten opzichte van normaal weefsel hebben waargenomen, hebben anderen lagere niveaus van TET-genexpressie in kanker gerapporteerd. Een andere mogelijkheid is dat kankercellen gecompromitteerde metabolische routes hebben die betrokken zijn bij de productie van de co-factor voor TET activiteit, 2-oxoglutaraat (zie hieronder).

Mutatie van TET2 in menselijke kanker

TET1 behoort tot een familie van eiwitten die de omzetting van 5mC naar 5hmC in zoogdier-DNA bevorderen. Er zijn drie geïdentificeerde familieleden die tot de TET-familie behoren: TET1, TET2, en TET3. TET1 bevindt zich op het menselijke chromosoom 10q21.3, terwijl TET2 zich op chromosoom 4q24 bevindt en TET3 op chromosoom 2p13.1. Het enzym TET1 bestaat uit een zinkvinger CXXC DNA-bindend domein, een cysteïnerijke regio en een 2-oxoglutaraat- en ijzer(II)-afhankelijk dioxygenase (2OGFeDO)-domein. TET3 bevat ook een N-terminaal CXXC domein . Echter, het TET2-gen onderging een chromosomale geninversie tijdens de evolutie, waardoor het CXXC-domein werd gescheiden van het katalytische domein en een nieuw CXXC-domeingen werd gecreëerd, IDAX/CXXC4 genaamd, dat codeert voor een negatieve regulator van TET2. Op basis van EST-profielen en expressiearrays vertoont TET1 de grootste expressie tijdens de embryogenese en geen relevante expressie in volwassen weefsels. TET2 komt het meest tot expressie in hematopoietische cellen en TET3 lijkt alomtegenwoordig tot expressie te komen in volwassen menselijke weefsels.

Leukemie is een ziekte waarbij, tijdens de normale hematopoietische stamceldifferentiatie, de klonale expansie van hematopoietische voorlopercellen in het beenmerg in een bepaald stadium van differentiatie wordt aangetast, waardoor een onevenwicht ontstaat tussen differentiatie en zelfvernieuwing. Onaangepaste expansie van hematopoiëtische voorlopercellen wordt voornamelijk veroorzaakt door een blokkering van de celrijping. Myelodysplastisch syndroom (MDS) stoornissen in de hematopoëse worden gekenmerkt door cytopenie (laag aantal bloedcellen), ineffectieve hematopoëse in een of andere cellijn en een verhoogd risico op transformatie tot acute myeloïde leukemie (AML) . Bij AML leidt de snelle groei van abnormale witte bloedcellen in het beenmerg tot een blokkering van de productie van diverse cellen van andere cellijnen.

TET2 is gemuteerd aangetroffen bij patiënten met myeloproliferatieve neoplasmen (MPN), MDS, AML en chronische myelomonocytische leukemie (CMML), en is het meest voorkomende gemuteerde gen bij MDS . Mutaties van TET1 of TET3 worden bij MDS niet waargenomen en de TET2-mutatie correleert niet met diverse andere bekende veel voorkomende mutaties. Interessant is dat isocitraat dehydrogenase 1/2 (IDH1/2)-mutaties zelden samen met TET2-mutaties worden aangetroffen, maar soortgelijke effecten hebben als TET2-mutaties op hematopoiëtische stamcellen (HSC’s) . Terwijl TET2-mutaties geassocieerd zijn met een verminderde algemene overleving bij AML in vergelijking met patiënten met een wild-type TET2, bevorderen TET2-mutaties bij MDS- en MPN-patiënten de progressie naar AML. Het TET2-gen bestaat uit in totaal elf exonen, die zich vertalen in een eiwitproduct van 2002 aminozuren. TET2-mutaties in myeloïde kankers zijn het vaakst waargenomen binnen exonen 3a en 10, die de langste exonen zijn. Zowel multipotente als gecommitteerde progenitorcellen in de hematopoietische lijn zijn het doelwit van TET2-mutaties in MPN, hetgeen impliceert dat TET2 een belangrijke rol speelt in de myelopoëse. Deleties van TET2 en verlies van heterozygositeit of uni-ouderlijke disomie werd waargenomen bij (9%) MDS/AML patiënten met gemuteerd TET2, waarbij het waarschijnlijk is dat het wild-type allel verloren gaat tijdens recombinatie, waardoor gemuteerd TET2 een verlies van functie fenotype kan bevorderen. Kosmider et al. constateerden dat 50% van de patiënten met gemuteerd TET2 genetische defecten hadden die gericht waren op de twee TET2-exemplaren. Mutaties in TET2 lijken te leiden tot functieverlies, wat suggereert dat het een tumoronderdrukkende rol zou kunnen spelen.

Inzicht in de onderliggende implicaties van het functieverlies van gemuteerd TET2 en zijn rol in myeloïde maligniteiten is een huidige onderzoeksprioriteit. Verschillende laboratoria hebben voorwaardelijke Tet2 knock-out muismodellen gegenereerd waarin kritische Tet2 exonen werden gericht. Moran-Crusio et al. stelden vast dat Tet 2-/- muizen splenomegalie ontwikkelden op de leeftijd van 20 weken, waarbij ze fenotypes vertoonden die gelijkaardig zijn aan deze waargenomen bij menselijke CMML patiënten met mutant TET2. De gegevens van de verschillende muismodellen leidden tot soortgelijke waarnemingen. Het verwijderen van Tet2 is niet embryonaal dodelijk. Een belangrijke observatie gedaan door Moran-Crusio et al. en door Ko et al. is dat hematopoietische stamcellen van Tet2-/- muizen een verhoogd vermogen hebben om het hematopoietische compartiment in vivo te repopuleren tijdens competitieve reconstitutie assays met concurrentie van HSCs van Tet2+/+ cellen. Analyse van verschillende organen van Tet2-/- muizen toonde aan dat verlies van Tet2 niet gecompenseerd wordt door een toename van Tet1 of Tet3 expressie. 5hmC niveaus zijn significant verlaagd in het beenmerg en de milt van Tet2-/- muizen . Tet2-/- muizen vertonen een toename van HSCs met een lichte toename van myeloïde progenitors, met een scheefgroei in hematopoiese richting monocyt/macrophage cel fates. Er wordt gesuggereerd dat een actief Tet2 de normale hematopoiese zou reguleren om een correcte distributie van de geslachtslijnen en een gecontroleerde differentiatie van HSCs te verzekeren. Van bijzonder belang is het effect van TET2 mutaties op de niveaus en patronen van 5mC in het genoom. De huidige gegevens zijn echter verre van duidelijk. Terwijl één rapport aangaf dat TET2-mutatie in AML geassocieerd is met een DNA-hypermethyleringsfenotype, suggereerden andere gegevens dat beenmergmonsters van patiënten met TET2-mutaties lage 5hmC-niveaus en DNA-hypomethylering hebben. De situatie wordt gecompliceerd door het feit dat hematopoietische maligniteiten vaak worden gekenmerkt door mutaties in verschillende epigenetische modifiers waaronder EZH2, IDH1, IDH2, MLL, DNMT3A, en ASXL1, waardoor eventuele eenduidige associaties mogelijk worden vertroebeld. In één studie bijvoorbeeld hadden acht van de elf patiënten met DNMT3A-mutaties (73%) in T-cellymfoom ook TET2-mutaties.

Mutaties in co-factor paden

5mC-oxidases zijn 2-oxoglutaraat-afhankelijke enzymen (figuur 2). Deze cofactor wordt in de tricarbonzuurcyclus uit isocitraat geproduceerd door het enzym IDH. Interessant is dat verschillende soorten menselijke tumoren mutaties in het IDH1-gen vertonen. IDH1-mutaties komen bijzonder vaak voor in glioma’s van graad II en III, waar zij bij tot 70% van de patiënten worden aangetroffen. Mutaties in IDH1 en IDH2 worden ook gezien in myeloïde leukemieën en enkele andere maligniteiten, maar met een lagere frequentie. Deze IDH1-mutaties zijn niet over het hele gen verspreid, maar worden bijna uitsluitend aangetroffen op aminozuurpositie 132. Deze bevinding suggereert dat dit specifieke gemuteerde IDH1-eiwit een “gain of function”-eigenschap heeft. Een verrassende ontdekking was dat de IDH1 codon 132 arginine naar histidine mutant de oncometaboliet 2-hydroxyglutaraat (2HG) produceert als reactieproduct in plaats van 2-oxoglutaraat . Het lijkt erop dat de isocitraat-oxidatiereactie die door deze mutant wordt uitgevoerd onvolledig is en alleen 2HG produceert. Bovendien is 2HG een competitieve remmer van veel, zo niet alle, 2-oxoglutaraat-afhankelijke enzymatische activiteiten. De TET-eiwitten vertegenwoordigen een klasse van dergelijke enzymen, en er is aangetoond dat 2HG een remmer is van TET1 en TET2 .

Een interessant correlaat van het hebben van gemuteerd IDH1 in glioomtumoren is dat de IDH1-mutanttumoren bijna altijd gepaard gaan met overvloedige genoombrede veranderingen in DNA-methylering, zoals blijkt uit wijdverbreide hypermethylering van CpG-eilanden. Dit fenotype wordt het CpG-island methylator fenotype (of CIMP) genoemd. Het is verleidelijk te veronderstellen dat CIMP in IDH1-mutante gliomen verband houdt met een falen van de 5hmC-productie in deze tumoren omdat de TET-activiteit door 2HG wordt gecompromitteerd. In feite, experimentele introductie van een IDH1 mutant construct in menselijke astrocyten leidde tot het ontstaan van een CIMP-achtige fenotype. Bovendien werd in conditionele knock-in muizen waarin de meest voorkomende Idh1-mutant R132H in de endogene Idh1-locus werd ingebracht en tot expressie werd gebracht in hematopoiëtische cellen, DNA-hypermethylering waargenomen. Echter, bij een directe vergelijking van 5hmC niveaus in DNA tussen IDH1 mutant en IDH1 wild-type glioma’s, zagen we geen substantiële verschillen tussen deze twee categorieën van hersentumoren . Daarom moet men in gedachten houden dat mutant IDH1 en zijn metaboliet product 2HG niet alleen TET enzymen beïnvloeden, maar ook veel lysine demethylases remmen die afhankelijk zijn van 2-oxoglutaraat en andere 2-oxoglutaraat-afhankelijke enzymen. Het disfunctioneren van deze lysine demethylases kan een secundair effect hebben op DNA methyleringspatronen op CpG eilanden.