ABT-263: A Potent and Orally Bioavailable Bcl-2 Family Inhibitor

Bindingaffiniteiten met Bcl-2-familie-eiwitten

Om te bepalen of ABT-263-geïnduceerde cytotoxiciteit kan worden toegeschreven aan de verstoring van intracellulaire Bcl-2-familie eiwit-eiwit interacties, werden coimmunoprecipitatiestudies uitgevoerd. ABT-263 induceerde een dosis-afhankelijke afname van Bim:Bcl-xL interacties binnen 2 uur na de behandeling in FL5.12-Bcl-xL cellen (Supplementary Fig. S3). Vergelijkbare patronen werden ook waargenomen voor de verstoring van Bim:Bcl-2 complexen in FL5.12-Bcl-2 cellen (gegevens niet weergegeven), wat aangeeft dat ABT-263 IL-3-afhankelijke celdood herstelt door verzwakking van het vermogen van Bcl-xL en Bcl-2 om proapoptotische factoren zoals Bim te sekwestreren. Het vermogen van ABT-263 om Bcl-2 familie eiwit-eiwit interacties te verstoren werd bevestigd in een zoogdier twee-hybrid systeem (Fig. 2B). ABT-263 remde de interactie van VP16-Bcl-xS met Gal4-Bcl-xL (schijnbare EC50 ∼50 nmol/L), terwijl het enantiomeer veel minder effectief was.

Om het werkingsmechanisme verder te onderzoeken, werd de activiteit van ABT-263 geëvalueerd in een reeks muizenembryonale fibroblast (MEF) cellen die zowel wild-type (WT) als cellen deficiënt in Bcl-x, Mcl-1, en Bax/Bak (DKO) bevatten. ABT-263 krachtig geïnduceerde celdood in Mcl-1-/- (EC50 ∼50 nmol / L), maar niet Bcl-x-/- (EC50 ≥10 umol / L) MEF-cellen (Supplementary Fig. S4A). Dit bevestigt het vermogen van ABT-263 om Bcl-xL, maar niet Mcl-1, functioneel te remmen in een cellulaire context en is consistent met eerdere waarnemingen met ABT-737 (7, 11, 13, 14, 26). Het enantiomeer was in beide systemen onwerkzaam. ABT-263 was ook ineffectief (EC50 ≥10 umol / L) in het doden van ofwel WT of DKO MEF-cellen, in overeenstemming met eerdere rapporten (14). In tegenstelling, etoposide, een algemene cytotoxische agent, evenals twee gerapporteerde kleine molecule BH3 mimetica , geïnduceerde celdood met vergelijkbare EC50s over alle vier MEF celtypes, wat suggereert dat deze verbindingen celdood induceren, althans gedeeltelijk, door Bcl-2 familie-onafhankelijke mechanismen (Supplementary Fig. S4C).

Om het vermogen van ABT-263 om direct apoptose te induceren in een menselijke tumorcellijn te beoordelen, werden Bax translocatie en het vrijkomen van cytochroom c gecontroleerd in de SCLC cellijn H146. Er is aangetoond dat H146 voor overleving afhankelijk is van Bcl-2 (25). ABT-263 induceerde een dosisafhankelijke afname van cytosolisch Bax gekoppeld aan een toename van cytosolisch cytochroom c binnen 2 uur na de behandeling (Fig. 2C-i). Het enantiomeer was niet in staat een soortgelijke respons op te wekken. De activering van Bax en het vrijkomen van cytochroom c werden bevestigd door microscopie (Fig. 2C-ii). Het 6A7 anti-Bax antilichaam, dat specifiek de conformationeel actieve vorm van Bax herkent, werd gebruikt om geactiveerd Bax in H146 cellen op te sporen. In overeenstemming met de fractionering studies, ABT-263 behandeling werd geassocieerd met een aanzienlijke toename van geactiveerde Bax. Dit kwam overeen met het vrijkomen van cytochroom c uit de mitochondriën naar het cytosol zoals blijkt uit verminderde punctaatstructuren en verhoogde cytosolische kleuring. ABT-263, maar niet zijn enantiomeer, induceerde ook een tijdsafhankelijke toename van de caspase-3 activiteit die na 2 uur aantoonbaar was en die een piek bereikte bij ∼6 uur (Fig. 2D). Dit effect was concentratieafhankelijk, met een EC50 ∼100 nmol/L op het 6-uur tijdstip (Fig. 2D, inzet). Daarentegen was camptothecine, een topoisomerase I-remmer die mitochondriale apoptose en daaropvolgende caspase-activering induceert (27, 28), pas na 24 uur in staat een toename van de caspase-3-activiteit teweeg te brengen (gegevens niet weergegeven). Deze gegevens wijzen erop dat ABT-263 direct Bcl-2 en Bcl-xL remt, waarbij pro-apoptotische factoren zoals Bim vrijkomen om een snelle activering van de mitochondriale apoptoseweg te induceren.

Om de breedte van de cellulaire activiteit van ABT-263 te evalueren, werd een panel van menselijke tumorcellijnen onderzocht die een scala van tumortypen omvatten. In overeenstemming met eerdere rapporten over ABT-737 (12) vertoonde ABT-263 single-agent activiteit in SCLC en hematologische maligniteiten, maar niet in de meerderheid van andere tumortypes (gegevens niet weergegeven). Om de activiteit binnen deze gevoelige tumortypes nader te onderzoeken, werd ABT-263 onderzocht in panels van cellijnen afkomstig van SCLC (n = 22) en hematologische maligniteiten (n = 23). In elk panel vertoonde ABT-263 een variatie in potentie, waarbij 32% (SCLC) en 48% (hematologisch) van de cellijnen zeer gevoelig waren (EC50 <1 μmol/L; Fig. 3). Het enantiomeer was >20-voudig minder actief in deze gevoelige cellen (aanvullende tabel S2).

Orale toediening van ABT-263 resulteert in de regressie van SCLC en ALL xenograft tumoren in vivo. Om deze waarnemingen in vivo uit te breiden, werd ABT-263 geëvalueerd in flank xenotransplantaatmodellen van enkele van de gevoelige SCLC en hematologische cellijnen. Na toediening van een dosis van 100 mg/kg eenmaal daags gedurende 21 opeenvolgende dagen, induceerde ABT-263 snelle en volledige tumorresponsen (CR) die gedurende verscheidene weken na het einde van de behandeling duurzaam waren in alle dieren die tumoren van het type H889 (SCLC) of RS4;11 (ALL) droegen (Fig. 4A). Gelijkaardige behandeling van muizen met H146 SCLC tumoren induceerde snelle regressie resulterend in CR in 60% en PR in 40% van de dieren (Fig. 4A). Geleidelijke opleving van de tumor werd waargenomen vanaf enkele weken na het einde van de dosering in dit model. De activiteit was dosisafhankelijk in het H146 xenograft model. Behandeling met ABT-263 aan 50 mg/kg gedurende 21 opeenvolgende dagen induceerde CR in 22% en PR in 44% van de dieren, terwijl 25 mg/kg een statistisch significante maar bescheiden tumorgroeiremming induceerde zonder waargenomen tumorregressie. ABT-263 werd goed verdragen (<5% gewichtsverlies) bij alle doses.

Om de blootstelling van ABT-263 te correleren met de werkzaamheid tegen tumoren, werd een steady-state farmacokinetische studie uitgevoerd waarbij niet-tumor-dragende muizen gedurende 3 dagen eenmaal daags p.o. werden gedoseerd, en de plasmaconcentraties van het geneesmiddel werden bepaald na de derde dosis. Zowel de piekplasmaconcentratie (Cmax) als de oppervlakte onder de plasmaconcentratiecurve (AUC) waren evenredig met de dosis en namen ruwweg lineair toe (aanvullende tabel S3). Een dosis van 100 mg/kg, die een algehele respons van 100% opleverde (algehele respons = CR + PR), gaf Cmax- en AUC-waarden van respectievelijk 7,7 μmol/L en 90 μmol/L uur. De blootstelling als gevolg van een dosis van 50 mg/kg, die een totale respons van 66% opleverde, was 5,4 μmol/L (Cmax) en 54 μmol/L u (AUC). Deze gegevens wijzen erop dat piekplasma geneesmiddelconcentraties van ABT-263 variërend van ∼5,4 tot 7,7 μmol/L zeer werkzaam zijn.

ABT-263 verhoogt de activiteit van chemotherapeutische middelen in vivo. De in vivo werkzaamheid van ABT-263 werd onderzocht in combinatie met algemeen gebruikte therapeutische middelen in verschillende agressieve modellen van hematologische maligniteiten. ABT-263 en rituximab werden onderzocht in het DoHH2 B-cel lymfoom flank xenograft model (Fig. 4B). Bij een dagelijkse dosis van 100 mg/kg p.o. gedurende 17 dagen, vertoonde ABT-263 een remming van de tumorgroei met 44%. Een enkele dosis rituximab van 10 mg/kg zorgde voor 84% remming van de tumorgroei. Noch ABT-263 noch rituximab alleen bereikten duurzame tumorregressie; de combinatie vertoonde echter een superieur effect, waarbij 70% CR en 10% PR werd bereikt. Deze combinatie resulteerde ook in een significante verbetering van de tumorgroeivertraging (>700%) ten opzichte van rituximab alleen (300%).

De werkzaamheid van ABT-263 alleen en in combinatie met een gemodificeerd R-CHOP-regime werd ook geëvalueerd in een GRANTA-519 flank xenograft model van mantelcellymfoom (Fig. 4B). ABT-263 toegediend aan 100 mg/kg p.o. gedurende 21 opeenvolgende dagen veroorzaakte een remming van de tumorgroei met 40%. Ter vergelijking, het R-CHOP regime remde de tumorgroei met 68% met 20% CR. De combinatie resulteerde in dramatische tumorregressies en complete tumorresponsen in alle geteste dieren zonder bewijs van tumorhergroei in vier van de negen evalueerbare tumoren.

Ten slotte onderzochten we het vermogen van ABT-263 om de effecten van chemotherapie te versterken in een model dat resistent is tegen ABT-263. In het OPM-2 flank xenograft model van multipel myeloom (in vitro EC50 = 6,7 μmol/L), remde ABT-263 toegediend gedurende 21 dagen aan 100 mg/kg de tumorgroei niet significant (Fig. 4B). Bortezomib toegediend in de maximaal getolereerde dosis (1 mg/kg i.v., qd × 3) remde de tumorgroei met 70% zonder CRs. ABT-263 versterkte de werkzaamheid van bortezomib met de combinatie resulterend in 95% tumorgroeiremming en een CR-percentage van 40%.

ABT-263 induceert een snelle maar reversibele trombocytopenie. We hebben onlangs gerapporteerd dat ABT-737 een snelle en reversibele trombocytopenie in dieren induceert als gevolg van remming van Bcl-2 familie-eiwitten en inductie van apoptose in circulerende bloedplaatjes zonder beenmergtoxiciteit (29). Zoals verwacht induceert ABT-263 ook trombocytopenie. Na een enkele p.o. dosis bij de hond daalde het aantal bloedplaatjes in de bloedsomloop binnen 2 uur met een dieptepunt na 6 uur en aanwijzingen voor een opleving binnen 24 uur (Fig. 5A). Om de effecten van langdurige dosering te bepalen, onderzochten we de farmacokinetische/farmacodynamische relatie na meerdere dagelijkse doses bij de hond (Fig. 5B). ABT-263 werd p.o. gedoseerd met 2 mg/kg/d gedurende 6 dagen, en vervolgens verhoogd tot 6 mg/kg/d gedurende nog eens 6 dagen. Het aantal trombocyten en de plasmaconcentratie van het geneesmiddel werden 6 uur na de behandeling bepaald om de waarschijnlijke nadirs van de trombocyten op dag 1 tot 4 en dag 7 tot 11 vast te stellen. Bij 2 mg/kg daalde het aantal trombocyten van een beginwaarde van ∼250.000/μL tot ∼125.000/μL bij de tweede dosis, en bleef daarna stabiel gedurende de resterende doses. De plasmaconcentratie van het geneesmiddel die 6 uur na de behandeling (C6h) werd verkregen, bleef constant op waarden die varieerden van 3,6 tot 4,2 μmol/L. Gebaseerd op het farmacokinetische profiel van ABT-263 (Supplementary Fig. S1) is de C6h ongeveer 2-maal lager dan de Cmax, wat aangeeft dat de piekplasmaconcentraties van het geneesmiddel die na meerdere doses van 2 mg/kg worden bereikt ∼7 tot 8 μmol/L zijn. Deze niveaus zijn vergelijkbaar met die verkregen na een dosis van 100 mg/kg p.o. bij muizen. Toen de dosis ABT-263 werd verhoogd tot 6 mg/kg/d, daalde het aantal trombocyten tot ∼50.000/μL op de tweede dag van deze hogere dosis en bleef relatief constant gedurende de gehele duur van het onderzoek. De C6h-waarden bij dit dosisniveau varieerden van 10,2 tot 14,8 μmol/L (Cmax, 20-30 μmol/L). ABT-263 werd in dit onderzoek goed verdragen zonder sterfte of nadelige klinische verschijnselen. Er waren echter enkele hematomen zichtbaar op de plaats van venapunctie, consistent met veranderingen in hemostase. Deze gegevens wijzen erop dat herhaalde dagelijkse blootstelling aan ABT-263 op niveaus die zeer effectief zijn gebleken in muismodellen resulteert in ∼50% reductie in circulerende bloedplaatjes bij honden. Bovendien worden plasmaconcentraties die vele malen hoger zijn dan het werkzame niveau goed verdragen, waarbij het aantal circulerende bloedplaatjes wordt verlaagd tot ∼50.000/μL.