Summary
Sucrose density gradient ultracentrifugation is een krachtige techniek voor het fractioneren van macromoleculen zoals DNA, RNA, en eiwitten. Daartoe wordt een monster dat een mengsel van macromoleculen van verschillende grootte bevat, gelaagd op het oppervlak van een gradiënt waarvan de dichtheid lineair toeneemt van boven naar beneden. Tijdens het centrifugeren sedimenteren macromoleculen van verschillende grootte met verschillende snelheid door de gradiënt. De sedimentatiesnelheid hangt, naast de centrifugale kracht, af van de grootte, vorm en dichtheid van de macromoleculen, alsmede van de dichtheid en viscositeit van de gradiënt. Op deze wijze worden de macromoleculen naar grootte gescheiden, waarbij de grotere naar de bodem sedimenteren en de lichtere dicht bij de top van de gradiënt blijven. De methode is bijzonder succesvol gebleken bij de fractionering naar grootte van grote DNA-moleculen en is uitgebreid gebruikt om de inductie en het herstel van DNA-breuken na blootstelling aan clastogene factoren te meten. Hier beschrijven we een aanpassing van deze methode die kan worden gebruikt bij de analyse van nieuw gesynthetiseerd DNA gevormd tijdens DNA-replicatie. Door grootte-analyse van nascent DNA in alkalische sucrose-gradiënten kunnen variaties in replicatie-activiteit worden gemeten na blootstelling van cellen aan DNA-beschadigende agentia. De methode is bijzonder nuttig omdat zij een onderscheid mogelijk maakt tussen DNA-schade-gemedieerde effecten op ketenverlenging versus replicon-initiatie, wat essentieel is voor een diepgaande analyse van het intra-S-fase controlepunt. Dit vermogen maakt de techniek uniek en rechtvaardigt de enigszins arbeidsintensieve aard.