Assembly Principles Learned from In Vitro Studies
Functionele bacteriële 30S en 50S ribosomal subunits kunnen in vitro worden gereconstrueerd uit rRNA plus elk van de ribosomale eiwitten. Gedetailleerde studies van de biochemische en biofysische principes die ten grondslag liggen aan ribosoom-assemblage in vitro hebben nuttige paradigma’s opgeleverd om onderzoek van ribosoom-biogenese in vivo te begeleiden.
Een van de eerste principes die door deze experimenten is onthuld, is dat assemblage van r-eiwitten tot ribosomale subeenheden op een hiërarchische manier plaatsvindt. Reconstitutie studies van bacteriële 30S ribosomale subeenheden definieerden een ‘assemblage kaart’ voor de volgorde van associatie van elk r-eiwit met rRNA. Op basis van hun volgorde in de bindingshiërarchie worden r-eiwitten aangeduid als primair (binding direct aan rRNA), secundair (binding is afhankelijk van primaire bindingseiwitten), of tertiair (binding is afhankelijk van secundaire bindingseiwitten). Hoewel een dergelijke “dependency map” een zeer nuttig uitgangspunt is gebleken, verschaft deze geen informatie over de kinetiek van de eiwitbinding. Het assemblagepad kan veeleer de volgorde weergeven waarin elk r-eiwit het meest stabiel met rRNA geassocieerd is. Bovendien houdt de assemblagekaart geen rekening met het vouwingstraject van 16S rRNA dat onafhankelijk is van r-eiwitten, noch met de rol die nucleolytische verwerking van rRNA-precursoren, die in vivo plaatsvindt, speelt bij de assemblage van ribosomen. Meer recent zijn deze aspecten van 30S subeenheid assemblage in meer detail onderzocht met behulp van technieken zoals chemische en hydroxyl radicaal probing van RNA conformatie om veranderingen in rRNP conformatie met de tijd te bepalen, en pulse-chase/massaspectrometrie (PC/MS) om kinetiek van r-eiwit binding aan rRNA te bepalen.
Een mogelijke verklaring voor de waarneming van primair bindende r-eiwitten in de assemblagekaart is dat hun bindingsplaatsen althans gedeeltelijk tot stand komen door de conformatie die 16S rRNA aanneemt onafhankelijk van r-eiwitten. In feite, consistent met dit idee en de opvatting dat ribosomen zijn geëvolueerd uit een RNA-katalysator, is aangetoond dat het 5′-domein van 16S rRNA zich kan vouwen en tertiaire contacten kan vormen in afwezigheid van alle r-proteïnen. Deze tertiaire structuur is vermoedelijk niet volledig stabiel in afwezigheid van eiwitcontacten en wordt dus hoogstwaarschijnlijk gestabiliseerd door de binding van r-eiwitten aan plaatsen die ontstaan door voorbijgaande conformaties die rRNA aanneemt wanneer het zich vouwt. Daarom suggereert het tweede principe dat rRNA-vouwing de basis vormt van r-eiwit binding tijdens ribosoom-assemblage.
Een derde principe dat naar voren is gekomen uit in vitro studies van bacteriële ribosomen is dat versterking van r-eiwit binding met rRNA optreedt naarmate de ribosoom-assemblage vordert. Veel r-eiwitten maken contact met meerdere nucleotiden op rRNA. Tijdgeresolveerde hydroxylradicaal footprinting heeft aangetoond dat sommige van deze nucleotiden eerder worden beschermd dan andere, wat suggereert dat naarmate de ribosoom biogenese vordert, r-eiwitten meer contacten maken met rRNA, en daardoor stabieler worden geïntegreerd in ribosomen.
Het aanvankelijk tot stand brengen van enkele contacten tussen r-eiwitten en rRNA stabiliseert mogelijk bepaalde RNA-conformatie, en induceert veranderingen in de rRNA-conformatie om bindingsplaatsen voor aanvullende (secundaire of tertiaire) r-eiwitten te verschaffen. Daarom consolideert binding van r-eiwitten de RNA-vouwwinsten en geeft richting aan het assemblageproces. Dit suggereert een model waarbij de assemblage verloopt via een afwisselende reeks van RNA-conformatieveranderingen en eiwitbinding, die achtereenvolgens de uiteindelijke RNA-structuur stabiliseren. Kinetische gegevens hebben aangetoond dat de assemblage van rijpe 30S subeenheden plaatsvindt via meerdere, parallelle RNA vouwingstrajecten, die alle convergeren naar het eindproduct. Dit heeft geleid tot het concept van een assemblagelandschap in tegenstelling tot een uniek pad waarlangs assemblage van ribosomale subeenheden plaatsvindt.
Ten slotte hebben in vitro studies aangetoond dat ribosoom-assemblage plaatsvindt in de 5′ tot 3′ richting. PC/MS en chemische sondering van de secundaire structuur van rRNA hebben aangetoond dat binding van r-eiwitten aan het 5′-domein van rRNA kan worden waargenomen voordat eiwitcontacten met het 3′-domein van rRNA tot stand zijn gebracht. Daarentegen hebben hydroxylradicaal footprinting assays een initiële uitbarsting van nucleotidebescherming langs het gehele 16S rRNA laten zien, hetgeen erop wijst dat RNA-klontering vanuit veel verschillende plaatsen verspreid over het RNA plaatsvindt, en dus wijst op een gebrek aan 5′ naar 3′ directionaliteit bij de assemblage. Deze tegenstrijdige waarnemingen kunnen worden verzoend door rekening te houden met de aard van de verschillende experimentele opstellingen. PC / MS meet de kinetiek van eiwit binding aan rRNA, en als zodanig alleen stabiel r-eiwit-rRNA interacties kunnen worden gedetecteerd, omdat r-eiwitten die zwak binden tijdens de puls kan worden afgewassen tijdens de chase. Footprinting assays, aan de andere kant, kan vangen nucleotide bescherming door zowel zwak-interagerende en stabiel-geassocieerd r-eiwitten. Tezamen geven deze gegevens aan dat, terwijl ribosoom assemblage over het gehele rRNA kan nucleeren, de uiteindelijke hechte associatie van r-eiwitten met rRNA plaatsvindt in een 5′ tot 3′ richting.
Het is belangrijk om te overwegen hoe deze in vitro experimenten al dan niet assemblage in vivo kunnen weerspiegelen. Bijvoorbeeld, wanneer ribosoom-assemblage in vivo plaatsvindt, is het gekoppeld aan transcriptie van rRNA, die vermoedelijk ook bijdraagt aan de waargenomen 5′ naar 3′ directionaliteit van r-eiwit associatie. rRNA kan zijn geëvolueerd om 5′ naar 3′ te vouwen als het wordt gesynthetiseerd, en op die manier r-eiwitten te incorporeren, waardoor assemblage wordt gekoppeld aan transcriptie van rRNA. Verder duiden de eis van een verhittingsstap tijdens de reconstitutie van ribosomale subeenheden in vitro en de identificatie van een aantal bacteriële mutanten die defect zijn in de productie van ribosomen op de noodzaak van trans-werkende factoren tijdens de ribosoom biogenese in vivo.