Basophil activation test: food challenge in a test tube or specialist research tool?

De gouden-standaard voor de diagnose van voedselallergie is orale voedsel challenge (OFC) . OFC vereist echter de inname van het vermoedelijke boosdoener-voedsel en kan een acute allergische reactie veroorzaken, die mogelijk ernstig is . Om deze reden moet OFC worden uitgevoerd in een gecontroleerde omgeving met de faciliteiten en de deskundigheid om allergische reacties en anafylaxie te behandelen, mochten deze zich voordoen. OFC kan aanzienlijke ongerustheid veroorzaken bij patiënten, ouders en zelfs klinisch personeel, aangezien er een aanzienlijk risico aan verbonden is. Daarom wordt, waar mogelijk, de diagnose voedselallergie vastgesteld door een recente overtuigende geschiedenis van een IgE-gemedieerde allergische reactie op het boosaardige levensmiddel, gecombineerd met bewijs van IgE-sensibilisatie voor hetzelfde levensmiddel door middel van een huidpriktest (SPT) en/of serumspecifiek IgE (sIgE) . OFC zijn voorbehouden voor de gevallen waarin de resultaten van SPT en/of sIgE niet eenduidig zijn. Met het toegenomen bewustzijn en de toegenomen prevalentie van voedselallergie en -sensibilisatie, worden meer en meer patiënten getest op voedselallergie. De afwezigheid van een geschiedenis van orale blootstelling aan allergene voedingsmiddelen, hetzij resulterend in een allergische reactie of bij afwezigheid van klinische symptomen, kan de interpretatie van de resultaten van de SPT en sIgE bijzonder uitdagend maken. Zuigelingen en jonge kinderen die nooit bepaalde allergene voedingsmiddelen hebben gehad, vormen een aanzienlijk deel van de patiënten die in allergieklinieken worden gezien en hebben vaak een OFC nodig om hun allergische status op te helderen. Dit resulteert in een toenemende vraag naar het uitvoeren van OFC. Allergiediensten hebben moeite om aan deze vraag te voldoen en patiënten moeten soms maanden wachten voordat zij een exacte diagnose van voedselallergie of voedseltolerantie krijgen door de OFC, wat kan leiden tot onnodige dieetbeperkingen en tot aanzienlijke ongerustheid in verband met diagnostische onzekerheid. OFC is ook de gouden standaard om de resolutie van voedselallergie te beoordelen, om de drempeldosis te bepalen en om de klinische respons op immunomodulerende behandelingen voor voedselallergie te monitoren. In onderzoekstudies moeten allergische patiënten vaak herhaalde OFC ondergaan om te beoordelen of er enige klinische verbetering is opgetreden.

De BAT, die een functionele assay is, heeft het potentieel om meer op het klinische fenotype van patiënten te lijken dan allergietests die alleen de aanwezigheid van allergeenspecifiek IgE detecteren. Eenvoudig gezegd kan de BAT gezien worden als een OFC in een reageerbuis, waar in plaats van het voedsel via de mond aan een kind te geven, basofielen die betrokken zijn bij acute allergische reacties blootgesteld worden aan een voedselextract in een reageerbuis. Ondanks de analogie zijn er verschillen aan te wijzen tussen de twee procedures en hun klinische toepassingen en hier ligt de vraag of de BAT de gouden standaard OFC loyaal kunnen nabootsen, d.w.z. of de BAT in vitro de allergische reactie kunnen reproduceren die in vivo optreedt tijdens een positieve OFC.

De basofielenactiveringstest

De BAT is een op flowcytometrie gebaseerde test waarbij de expressie van activeringsmarkers op het oppervlak van basofielen wordt gemeten na stimulatie met allergeen -Fig. 1. Een positieve basofielenactiveringstest kan worden beschouwd als een in vitro surrogaat van een acute allergische reactie in vivo. In een studie bij patiënten die allergisch zijn voor het gif van vliesvleugeligen, werd zowel in vitro na stimulatie met het gif van de gele jas of de honingbij als ex vivo na een positieve steektest een opregulatie van basofiele activeringsmarkers waargenomen. In dezelfde studie was er een algemene overeenstemming tussen de klinische presentatie (systemische reactie versus grote lokale reactie) en de resultaten van de BAT, wat suggereert dat de BAT een potentiële biomarker van anafylaxie is. Ook bij voedselallergische patiënten werd een goede overeenkomst gevonden tussen de resultaten van de BAT en de uitkomst van OFC. Bij alfa-gal allergische patiënten met vertraagde onmiddellijke allergische reacties op rood vlees, viel de activering van basofielen ex vivo in bloed afgenomen op verschillende tijdstippen samen met de ontwikkeling van systemische allergische reacties in vivo tijdens de OFC. De resultaten van deze studie versterken de rol van basofielen in voedselgeïnduceerde IgE-gemedieerde allergische reacties en anafylaxie.

Verschillende celoppervlaktemarkers kunnen worden gebruikt om basofielen in volbloed te identificeren, waaronder IgE, CD123 (met HLA-DR), CCR3 of CRTH2 (met CD3) of CD203c .

In perifeer bloed wordt IgE gedetecteerd op basofielen, dendritische cellen, eosinofielen, monocyten, macrofagen, B-cellen en bloedplaatjes; het is dus niet specifiek voor basofielen. CD123 is de lage affiniteit (α) subeenheid van de IL-3 receptor. Het komt in hoge mate tot expressie op plasmacytoïde dendritische cellen en basofielen en in lage mate op monocyten, eosinofielen, myeloïde dendritische cellen en subsets van hematologische progenitorcellen. Aanvullende kleuring met HLA-DR maakt onderscheid tussen HLA-DR-negatieve basofielen en HLA-DR-positieve dendritische cellen en monocyten. CCR3 is de receptor voor chemokines van het C-C-type (bv. eotaxine, MCP en RANTES) en komt sterk tot expressie op basofielen en eosinofielen, maar ook op Th1- en Th2-cellen. CRTH2 is een andere marker die tot expressie komt door basofielen, eosinofielen en T-cellen, en dus net als CCR3 een T-celmarker, zoals CD3, nodig heeft om basofielen van T-cellen te onderscheiden. CD203c komt constitutief en specifiek tot expressie op basofielen en kan daarom worden gebruikt als een enkele identificatiemerker of in combinatie met andere merkers.

Na stimulatie met allergeen wordt de expressie van verschillende eiwitten op het oppervlak van basofielen opgehoogd, namelijk CD63 en CD203c . CD63 is een lysosomaal-geassocieerd membraaneiwit (LAMP), dat niet tot expressie komt op het oppervlak van basofielen in rust, maar alleen op het membraan van de granules binnenin de cellen. Wanneer de granules samensmelten met de plasmatische membraan van de basofielen tijdens degranulatie, komt CD63 tot expressie op het oppervlak van basofielen. CD203c is een enzym dat fosfodiëster- en fosfosulfaatbindingen splitst, waarbij achtereenvolgens 5′-nucleotiden hydrolytisch worden verwijderd uit de 3′-hydroxy-termini van oligonucleotiden. Het komt uitsluitend en constitutief in lage concentraties tot expressie op het oppervlak van basofielen en mestcellen en de expressie ervan neemt toe bij celactivering. Basofiele activeringsmarkers lijken twee verschillende groepen markers te vormen die gelijktijdig worden geüpreguleerd: een groep die CD63, CD107a en CD107b omvat en een andere die CD203c, CD13 en CD164 omvat. CD63 en CD203c zijn de meest gebruikte basofielenactiveringsmarkers.

De laboratoriumprocedure van de BAT bestaat uit drie fasen: celstimulatie, celkleuring en flowcytometrie-Fig. 1. Bloed moet zo spoedig mogelijk na de bloedafname worden verwerkt, aangezien basofielen na verloop van tijd hun levensvatbaarheid en reactiviteit verliezen. Er zijn echter studies uitgevoerd met monsters die tot 24 uur bij +4 °C waren bewaard. Voor BBT is een klein volume bloed nodig (ca. 1-2 ml, afhankelijk van het aantal omstandigheden). Voor celstimulatie kunnen ruwe allergeenextracten of gezuiverde of recombinante allergenen worden gebruikt. Er moeten verschillende allergeenconcentraties worden gebruikt, aangezien de gevoeligheid van de basofielen voor specifieke allergeenstimulatie van patiënt tot patiënt verschilt.

De resultaten van BAT kunnen worden bepaald in termen van percentage basofielen die de gedefinieerde activeringsmarker tot expressie brengen of in termen van gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) door berekening van de stimuleringsindex, d.w.z. de verhouding tussen de MFI van de geselecteerde conditie en de MFI van de negatieve controle. De eerste methode wordt gewoonlijk gebruikt voor CD63, aangezien CD63 niet tot expressie komt in cellen in rust en de expressie ervan na activering bimodaal is. De laatste wordt gewoonlijk gebruikt voor CD203c dat reeds tot expressie komt in cellen in rust en waarvan de toename na stimulatie door allergenen unimodaal is-Fig. 2.

In allergische patiënten resulteert allergeengeïnduceerde basofielenactivering gewoonlijk in een klokvormige dosis-responscurve, waarbij toenemende concentraties van het allergeen (gewoonlijk 5-6 logverschil) leiden tot een geleidelijke toename van de expressie van de basofielenactiveringsmarkers tot een plateau wordt bereikt-Fig. 3.

Er is een grote mate van variabiliteit in de basofiele reactie op allergeen tussen individuen. Om deze heterogeniteit tot uitdrukking te brengen en de basofiele respons tussen verschillende patiënten te vergelijken, kunnen op basis van de dosis-responscurve diverse parameters worden bepaald, zoals CD-max en EC50 (50 % effectieve concentratie) of CDsens. CD-max is de maximale activering en komt overeen met het maximale aandeel geactiveerde basofielen bij elke concentratie allergeen. EC50 is de effectieve dosis bij 50 % van de maximale activering, en kan ook worden weergegeven als CDsens. CDsens werd voor het eerst beschreven door Johansson en is het omgekeerde van de half-maximale effectieve concentratie, d.w.z. de concentratie waarbij de activatie van de basofielen de helft bedraagt van de maximale activatie, maal 100, en kan worden berekend met de formule CDsens = 1/EC50 × 100. CDmax en CDsens zijn maatstaven voor respectievelijk de basofiele reactiviteit en de basofiele gevoeligheid. Basofiele reactiviteit kan worden gedefinieerd als de mate van activering van de basofielen, d.w.z. het percentage geactiveerde basofielen, en kan ook worden gemeten als het percentage CD63-positieve basofielen bij verschillende allergeenconcentraties of als de verhouding van het percentage CD63-positieven na stimulatie met allergeen en met anti-IgE. De gevoeligheid van de basofielen verwijst naar de concentratie allergeen waarbij de basofielen geactiveerd worden en kan worden uitgedrukt als een percentage van de maximaal effectieve dosis (bv. EC5, EC10) naast de eerder genoemde EC50 en CDsens. Figuur 3 geeft de basofielenrespons weer van twee verschillende individuen, de ene met een hogere basofielenreactiviteit en -gevoeligheid (blauw) en de andere met een lagere basofielenreactiviteit en -gevoeligheid (rood), d.w.z. met een kleiner aandeel basofielen dat geactiveerd wordt als reactie op hogere concentraties van het allergeen. Shreffler en Patil hebben een nieuwe parameter voorgesteld om de reacties van de basofielen te meten, de oppervlakte onder de dosis-respons curve, die het voordeel heeft van een combinatie van basofielreactiviteit en basofielgevoeligheid.

Het gebruik van de basofielactiveringstest om voedselallergieën te diagnosticeren

In een recent gepubliceerde studie evalueerden we de bruikbaarheid van de BAT om pinda-allergie te diagnosticeren in een goed gekarakteriseerde populatie van pinda-allergische, pinda-gesensibiliseerde en niet-pinda-gesensibiliseerde kinderen. De BAT toonde een hoge accuraatheid (97%) in het diagnosticeren van pinda-allergie en maakte een reductie van het aantal benodigde OFC met 66% mogelijk. Wij hebben de diagnostische cut-offs gevalideerd in een prospectief en onafhankelijk gerekruteerde populatie en de diagnostische prestatie van BAT was nog steeds zeer goed in deze tweede studiepopulatie. In de afgelopen jaren hebben andere studies de prestaties van BAT beoordeeld bij de diagnose van allergie voor verschillende voedingsmiddelen, waaronder pinda, koemelk, ei, tarwe, hazelnoot, schaaldieren en perzik, en bij de diagnose van pollen-voedselsyndromen – Tabel 1. Casusrapporten en kleine series van gevallen hebben gesuggereerd dat de BBT ook nuttig kunnen zijn voor de diagnose van allergie voor sesam en voor minder vaak voorkomende uitlokkers van IgE-gemedieerde voedselallergische reacties, zoals rijst en kortketenige galacto-oligosachariden die aanwezig zijn in prebiotica. In een onlangs gepubliceerde stellingname van de Europese Academie voor Allergie en Klinische Immunologie wordt een overzicht gegeven van de klinische toepassingen van de BBT.

Verschillende factoren kunnen van invloed zijn op de diagnostische prestaties en afkapwaarden van de BBT in verschillende studies, waarvan sommige verband houden met de studiepopulatie, sommige met de studieopzet, sommige met de laboratoriumprocedure en met de methodologie die is gebruikt voor de gegevensanalyses-Tabel 2. Bestaande studies zijn heterogeen wat de meeste van deze aspecten betreft, wat hun vergelijkbaarheid en een ruimere toepassing van de in specifieke studies bepaalde diagnostische cut-offs beperkt. Het criterium om een voedselallergie te diagnosticeren is allergeenspecifiek en de diagnostische nauwkeurigheid is mogelijk niet hetzelfde voor verschillende allergenen. Bovendien zijn de cut-offs die in één populatie bepaald zijn, niet noodzakelijk rechtstreeks overdraagbaar op een andere populatie van een andere geografische locatie, beoordeeld in een ander Allergiecentrum. Een beperking van de BBT is het feit dat een klein deel van de geteste patiënten non-responder basofielen heeft (d.w.z. basofielen die reageren op een niet-IgE-gemedieerde positieve controle, maar niet op IgE-gemedieerde stimulantia) en daarom een oninterpreteerbaar resultaat van de test hebben. Bijkomende uitdagingen bij het vertalen van de BAT van een onderzoeksmethode naar een diagnostische test in de kliniek hebben te maken met de standaardisatie van de test en de reproduceerbaarheid ervan, en ook met de kosteneffectiviteit van het opnemen van de BAT in de diagnostische aanpak van patiënten met een vermoeden van voedselallergie. Deze aspecten zijn nog niet vastgesteld en vereisen nader onderzoek.

De methodologie die wordt gebruikt om de laboratoriumprocedure uit te voeren en de flowcytometriegegevens te analyseren, kan van grote invloed zijn op de resultaten die voor de BAT worden verkregen en bijgevolg op de diagnostische nauwkeurigheid ervan. Zo kan bijvoorbeeld de identificatie van basofielen met een anti-IgE-antilichaam de cellen activeren en de resultaten veranderen die met een andere methode voor de identificatie van basofielen worden verkregen. De expressie van bepaalde basofiele identificatiemerkers, zoals CCR3 en CD123, kan veranderen na activering van de basofielen. In een recente studie hebben wij beschreven dat bij ongeveer een kwart van de patiënten de expressie van CD123, zoals gedetecteerd door flowcytometrie, kan verminderen na activering van de basofielen en derhalve kan leiden tot een significant verlies van geactiveerde cellen bij gebruik van methoden die op deze marker berusten om basofielen te identificeren. Dit zou kunnen resulteren in een verhoogd aantal misdiagnoses, met name fout-negatieven, met belangrijke gevolgen voor individuele patiënten. Door de basofiel-specifieke merker CD203c aan de gating-strategie toe te voegen, bleef het aantal cellen behouden en kon het aantal fout-negatieven worden verminderd (van 5 tot 1 %). De gewijzigde afleidingsstrategie verbeterde zowel de gevoeligheid (van 88 naar 98 %) als de specificiteit (van 94 naar 96 %) van de BAT, wat resulteerde in een algemene verbetering van de nauwkeurigheid van de BAT voor de diagnose van pinda-allergie van 91 naar 97 % – Fig. 4. Om de BBT met succes uit te voeren en te interpreteren, “zit de duivel in het detail”; daarom is het zeer belangrijk om de methodologische aspecten van de BBT zorgvuldig te overwegen.

Over het geheel genomen heeft de BAT als diagnostische test een hoge specificiteit en positieve voorspellende waarde laten zien. Wij hebben de voor pinda-allergie bepaalde diagnostische cut-offs gevalideerd in een onafhankelijke prospectief gerekruteerde populatie en de specificiteit en positief voorspellende waarde van BAT bereikten 100%. De hoge specificiteit is een belangrijke aanvulling op bestaande allergietests, zoals SPT en sIgE, die een hoge sensitiviteit hebben maar niet erg specifiek zijn. De hoge specificiteit houdt in dat een positieve BAT de diagnose voedselallergie met zekerheid bevestigt, maar dat een negatieve BAT de diagnose niet noodzakelijk uitsluit. Afhankelijk van de kosten-batenverhouding en de veiligheidsaspecten kan OFC worden uitgevoerd bij patiënten bij wie de BAT een onduidelijk resultaat oplevert (namelijk patiënten met niet-responderende basofielen) of bij patiënten bij wie de BAT een onduidelijk resultaat oplevert en bij patiënten bij wie de BAT negatief was.

De aanpak om te beslissen over de noodzaak van OFC na de BAT hangt ook af van de manier waarop het resultaat van de BAT wordt bekeken in de context van de resultaten van andere allergietests, hetzij in combinatie, wanneer alle beschikbare resultaten tegelijkertijd worden bekeken, hetzij sequentieel, waarbij de BAT alleen wordt uitgevoerd bij patiënten die gelijkluidende of discordante resultaten voor de andere allergietests hadden. In onze eerder geciteerde studie over pinda’s hebben we de prestaties van de BAT vergeleken met die van andere allergietests die parallel werden uitgevoerd. BAT presteerde beter dan SPT, specifiek IgE voor pinda en specifiek IgE voor Ara h 2 en andere pinda-componenten. Uitgaande van afzonderlijke tests was de BAT de meest accurate diagnostische test. Om de beschikbare informatie zo goed mogelijk te benutten, kunnen de resultaten van de BAT worden gebruikt in combinatie met de resultaten van andere tests. In het algemeen geldt echter dat hoe meer tests worden gebruikt, hoe groter de diagnostische onzekerheid (en hoe groter het aantal OFC), aangezien verschillende tests tegenstrijdige resultaten kunnen opleveren. Beter dan het gelijktijdig combineren van de resultaten van allergietests kan zijn om de BAT achtereenvolgens te gebruiken in de diagnostische work-up voor voedselallergie, bij patiënten die een onduidelijk resultaat hadden voor de andere allergietests . Deze aanpak kan ook uit het oogpunt van de haalbaarheid voordelig zijn, gezien de praktische aspecten van de uitvoering van de BBT, namelijk de behoefte aan vers bloed en de vereiste middelen en technische expertise. Het zou niet praktisch of zelfs noodzakelijk zijn om de BBT uit te voeren bij alle patiënten bij wie een voedselallergie wordt vermoed. De BBT kan worden voorbehouden voor geselecteerde gevallen, met name wanneer er geen voorgeschiedenis is van orale blootstelling aan het voedsel of wanneer de klinische voorgeschiedenis onduidelijk is en de resultaten van SPT en specifiek IgE geen uitsluitsel geven. In moeilijke gevallen kan de BAT worden gebruikt als tweede stap in het diagnostisch onderzoek, na de klinische anamnese en SPT en/of sIgE, alvorens te besluiten of een OFC nodig is – Fig. 5. De diagnostische nauwkeurigheid en superioriteit van BBT ten opzichte van huidpriktesten en specifiek IgE moeten worden geëvalueerd met andere allergenen en in andere klinische settings.

Behalve het maken van onderscheid tussen voedselallergische en voedseltolerante patiënten, kunnen de resultaten van de BAT aanvullende informatie verschaffen over de kenmerken van door voedsel geïnduceerde reacties die nuttig kunnen zijn bij de behandeling van allergische patiënten. Er is aangetoond dat verschillende parameters van de BBT verschillende kenmerken van de allergische reacties weerspiegelen, waarbij de proportie geactiveerde basofielen (basofielenreactiviteit) de ernst van de allergische symptomen weerspiegelt en de dosis waarbij basofielen in vitro op een allergeen reageren (basofielengevoeligheid) de dosis van het voedseleiwit weerspiegelt waarbij patiënten tijdens OFC reageerden. Deze bevindingen bij pinda-allergie zijn gereproduceerd in een later gepubliceerde studie en kunnen van toepassing zijn op andere voedselallergieën. In ieder geval moet het resultaat van de BAT worden gezien in de context van andere klinische kenmerken en risicofactoren voor ernst, bij de beoordeling van voedselallergische patiënten.

De basofielenactiveringstest gebruiken om de verwerving van tolerantie voor voedingsmiddelen en de klinische respons op immunomodulerende behandelingen voor voedselallergie te monitoren

Het klinische fenotype van allergische en tolerante patiënten goed weerspiegelen, BAT kan nuttig zijn bij het beoordelen van de natuurlijke oplossing van voedselallergieën die gewoonlijk na verloop van tijd overgroeid zijn, zoals koemelk-, ei- en tarweallergieën, en bij het bepalen wanneer de patiënten opnieuw moeten worden uitgedaagd om te beoordelen of het voedsel opnieuw in het dieet kan worden geïntroduceerd. BAT heeft aangetoond verschillende fenotypes van patiënten met koemelk- en ei-allergieën te kunnen onderscheiden, namelijk patiënten die uitgebreid verhitte vormen van deze voedingsmiddelen tolereren en toch reageren op onverhitte voedingsmiddelen, en patiënten die reageren op zowel uitgebreid verhitte als onverhitte melk of ei.

BAT is ook gebruikt om de klinische respons op immunomodulerende behandelingen voor voedselallergie in onderzoekstudies te monitoren. Over het algemeen, in studies van immunotherapie voor voedingsmiddelen zoals pinda , koemelk en ei , heeft BAT een verminderde reactiviteit van de basofielen op de respectieve voedselallergenen aangetoond met behandeling, die vooral duidelijk is bij de lagere concentraties van het allergeen, als gevolg van de afname van de gevoeligheid van de basofielen. Interessant is dat Thyagarajan et al. aantoonden dat tijdens pinda OIT de vermindering van basofielactivering niet alleen optrad als reactie op pinda, maar ook op het bystander-eiallergeen (bij ei-allergische patiënten) en op anti-IgE maar niet op de niet-IgE-gemedieerde positieve controle, fMLP (formyl-methionyl-leucyl-fenylalanine), wat suggereert dat de route stroomafwaarts van de IgE-receptor anergisch was geworden. In een studie van omalizumab bij pinda-allergische patiënten daalde de expressie van CD203c in de BBT tijdens de behandeling en keerde terug naar de niveaus van vóór de behandeling na het staken van deze therapie. Tenslotte toonde het Chinese kruidengeneesmiddel FAHF-2 ook een significant remmend effect op de basofielenrespons bij patiënten met allergie voor verschillende voedingsmiddelen, parallel aan klinische verbetering.

Alles bij elkaar illustreren deze studies dat de BAT in de loop van de tijd bij dezelfde patiënten kunnen worden herhaald om de veranderingen in de immuunrespons op voedselallergenen te beoordelen met een of andere interventie, of het nu orale immunotherapie, sublinguale immunotherapie, omalizumab, of andere immunomodulerende therapeutische of preventieve strategieën zijn.

Toekomstige perspectieven

Met het oog op de toepassing van BBT voor de diagnose van voedselallergie in de klinische praktijk, is verder onderzoek nodig om diagnostische cut-offs te definiëren en te valideren voor specifieke allergenen en bij verschillende patiëntenpopulaties. Standaardisatie van de laboratoriumprocedures zou belangrijk zijn om de vergelijkbaarheid van de resultaten van BAT tussen centra mogelijk te maken. Dit zou standaardisatie vereisen van het protocol voor de in vitro assay en van de flowcytometrie en data-analysemethoden. Het gebruik van een vergelijkbare methodologie voor BAT zou het mogelijk maken om de resultaten van BAT in verschillende centra te vergelijken, zowel voor klinische als voor onderzoeksdoeleinden, inclusief in multicenter studies.

Als BAT eenmaal op de juiste manier gevalideerd is voor de diagnose van specifieke voedselallergieën, kan het gebruikt worden om de klinische respons op immunomodulerende behandelingen te monitoren, zoals allergeenspecifieke immunotherapie en biologische geneesmiddelen. BAT heeft ook een enorm potentieel voor mechanistische studies om ons begrip van de rol van basofielen in de immuunmechanismen van voedselallergie en voedseltolerantie te verbeteren.