Biosynthese van trans-4-hydroxyproline door recombinante stammen van Corynebacterium glutamicum en Escherichia coli

Bouw van trans-Hyp producerende recombinante stammen

Er zijn verschillende genen gespeculeerd als putatief L-proline 4-hydroxylase gen in de database, waaronder genen in Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 en Dactylosporangium. sp. Met behulp van PCR hebben we de putatieve genen van P4H uit P. stutzer en B. bronchiseptica RB50 gekloond en verkregen, p4hP en p4hB genaamd. Ze werden na ontsluiting aan de overeenkomstige plasmiden geligeerd en respectievelijk in C. glutamicum en E. coli omgezet. De lengte van p4hP was 918 bps terwijl p4hB 924 bps was. Deze sequenties waren 100% identiek aan de gerapporteerde genen in NCBI. Het gen van trans-P4H van Dactylosporangium sp. (p4hD) werd met succes tot expressie gebracht in E. coli en kan L-proline omzetten met goede enzymatische eigenschappen. De lengte van p4hD bedroeg 816 bps en codeerde voor een polypeptide van 272 aminozuren met een molecuulgewicht van 29.715 dalton. In deze studie werd p4hD toegepast met enkele modificaties op de nucleaire basen. De oorspronkelijke gensequentie van p4hD werd geanalyseerd (http://www.kazusa.or.jp/codon/) en de resultaten toonden aan dat er enkele zeldzame codons waren voor zowel C. glutamicum als E. coli. Er is gerapporteerd dat zeldzame codons sterk geassocieerd zijn met een laag niveau van eiwitexpressie. Codon optimalisatie voor heterologe eiwitexpressie heeft vaak aangetoond de eiwitexpressie drastisch te verhogen. Daarom werden de zeldzame codons van het p4hD gen vervangen door de codons die met hoge frequentie in C. glutamicum werden gebruikt en werd het GC-gehalte aangepast van 73% tot 61% door synonieme conversie, die dicht bij die van C glutamicum lag. Het gemodificeerde gen van p4hD werd gesynthetiseerd volgens de bovenstaande modificaties (Additional file 1).

De expressie van P4H is een van de belangrijke aspecten op de bouw van trans-Hyp biosynthetische route. Figuur 2 toont de SDS-PAGE van trans-P4Hs uitgedrukt in recombinant C. glutamicum en E. coli. Alle recombinante trans-P4H’s werden tot expressie gebracht als oplosbare eiwitten zonder inclusion bodies. Het was duidelijk dat de recombinante trans-P4H’s in E. coli veel meer tot expressie kwamen dan die in C. glutamicum (figuur 2). Vele factoren zijn van invloed op de expressie van vreemde eiwitten, waaronder promotors, het gastheer-vectorsysteem en culturele omstandigheden enz. Aangezien het de eerste keer was dat trans-P4Hs tot expressie werden gebracht in C. glutamicum, zullen meer uitgebreide studies zoals promoterselectie en optimalisatie van de kweekomstandigheden worden overwogen in ons toekomstig werk.

Vergelijking van P4H-activiteiten

Oxygenases worden op grote schaal toegepast in de industrie, aangezien zij de zeer specifieke oxyfunctionalisering van niet-geactiveerde C-H-bindingen onder milde omstandigheden kunnen katalyseren, met name het overbrengen van moleculaire zuurstof naar een substraat . P4H behoort tot een familie van 2-oxoacide-afhankelijke dioxygenase, die een monomeer eiwit is en de monomere in plaats van polymere substraten gebruikt . De activiteiten van trans-P4Hs met recombinante hele cellen werden in deze studie gemeten (tabel 1). Uit onze gegevens bleek dat het tot expressie gebrachte eiwitniveau en de enzymatische activiteit hoger waren bij 30°C. De resultaten toonden ook aan dat de plasmiden zeer stabiel waren, aangezien de plasmidenstabiliteit van recombinante E. coli en C. glutamicum stammen aan het eind van de fermentatie allemaal meer dan 98% was.

De recombinante cellen met expressie van verschillende genen vertoonden verschillende niveaus van katalytische activiteiten ten opzichte van L-proline. De activiteit van trans-P4H uitgedrukt door E. coli BL21/ pET28a-p4hD was het hoogst van alle geconstrueerde recombinante stammen. De nieuw gekloonde en tot expressie gebrachte genen van P. stutzeri en B. bronchiseptica vertoonden ook geïnteresseerde activiteiten. Wat de verschillende gastheerstammen betreft, was E. coli beter vertegenwoordigd dan C. glutamicum, wat in verband kan worden gebracht met de prestatie van het corresponderende plasmide. Vier L-proline producerende stammen van C. glutamicum werden gebruikt als expressiegastheer en de resulterende recombinante stammen vertoonden verschillende enzymatische activiteiten. De hoogste specifieke enzymactiviteit onder de C. glutamicum stammen was 40,7 U/mg – natte cel door C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB. De specifieke enzymactiviteit van recombinant E. coli/pET28a -p4hD bedroeg echter tot 60,4 U/mg – natte cel. De groei van de drie recombinante E. coli-stammen was vergelijkbaar. Maar er was een significant verschil tussen de recombinante C. glutamicum stammen. De recombinante C. glutamicum stammen met hogere specifieke enzymatische activiteiten groeiden minder dan die met lagere specifieke enzymatische activiteiten. Bovendien was de enzymatische activiteit van E. coli BL21 /pET28a -p4hD vergelijkbaar met die van E. coli W1485/pWFH1 en hoger dan die van E. coli BL21/pET24-p4h1 van . Het p4hD in E. coli W1485/pWFH1 was het originele p4hD in Dactylosporangium sp., terwijl p4hD in E. coli BL21/pET24-p4h1 gemodificeerd was. Hoewel de codon-optimalisatie in deze studie was ontworpen voor C. glutamicum, gaven de resultaten aan dat het ook succesvol was in E. coli.

Trans-Hyp productie in kolven

De productie van trans-Hyp door verschillende recombinante C. glutamicum en E. coli stammen werd ook getoond in tabel 1. De opbrengst van trans-Hyp door deze recombinante stammen was zowel afhankelijk van de enzymatische activiteit van P4H als van de celgroei. E. coli BL21/ pET28a-p4hD had de hoogste opbrengst, wat samenviel met zijn specifieke enzymatische activiteit. Hoewel de recombinante E. coli-stammen in het productiemedium op vergelijkbare wijze groeiden, was er een significant verschil in de productie van trans-Hyp, die niet op hetzelfde niveau bleef met de specifieke enzymatische activiteit. De productie van trans-Hyp door recombinant C. glutamicum stammen was ook veel lager dan die van E. coli BL21/pET28a-p4hD. Dit was zowel te wijten aan de lagere expressie van trans-P4H als aan de lagere celgroei in C. glutamicum. De L-proline productie van vier C. glutamicum stammen was ook minder dan 1 g/L. Er was weinig verschil in trans-Hyp productie tussen de recombinante stammen van C. glutamicum met hetzelfde gen p4hD, ondanks dat sommige stammen betere enzymatische prestaties en proline productie hadden.

Het gebruik van de recombinante stammen om direct trans-Hyp te synthetiseren uit glucose via fermentatie werd bereikt omdat zowel de enzymen als de precursoren die nodig zijn in het proces beschikbaar waren. De tot expressie gebrachte buitenlandse trans-P4H’s katalyseerden de hydroxylering van L-proline op de trans-4 positie, terwijl 2-ketoglutaraat door glucose via de TCA-cyclus werd aangevoerd en vervolgens oxidatief werd gedecarboxyleerd tot succinaat (figuur 1). Er werd gerapporteerd dat proline vereist was bij de productie van Hyp door recombinant E. coli alleen met p4h-gen. De koolstof in proline die tijdens de fermentatie werd toegevoegd, vloeide alleen naar aminozuren die werden gesynthetiseerd uit tussenproducten van de TCA-cyclus en niet naar gluconeogenese. De geaccumuleerde Hyp was echter op een relatief hoog niveau zelfs zonder de toevoeging van proline in deze studie. Men zou kunnen begrijpen dat Corynebacterium een krachtige biosynthetische route voor proline had. De biosynthetische route van proline is ook geïdentificeerd in E. coli, wat kan bijdragen aan de synthese van trans-Hyp door recombinante E. coli stammen. De modificatie van de proline pathway in E. coli verhoogt de opbrengst van Hyp, terwijl de vorming van Hyp ook de feedback inhibitie van proline kan verlichten. De hoeveelheid proline (0-4 mM) bevorderde de productie van trans-Hyp. Voortdurende toevoeging van L-proline verbeterde de productie-opbrengst echter niet significant (tabel 2). In deze studie was de kweekduur beduidend korter dan die gerapporteerd in de literatuur, wat zou kunnen worden toegeschreven aan de verschillende gebruikte media en ook aangaf dat er een groot potentieel was met optimalisatie. In feite werd 2,28 g/L trans-Hyp geproduceerd door recombinant E. coli zonder toevoeging van L-proline in kolven met een kleine wijziging van de media en 6,72 g/L werd bereikt door slechts 4 mM L-proline toe te voegen.

Om de biosynthese van trans-Hyp door recombinant C. glutamicum en E. coli verder te verhogen, moeten ook alternatieve benaderingen worden overwogen. In E. coli zou de afbraak van proline overwonnen moeten worden. Hoewel de trans-Hyp productie door een putA mutant van E. coli niet verder werd verbeterd, werd de opbrengst op basis van het gebruikte proline wel sterk verhoogd. Zowel in C. glutamicum als in E. coli is de expressie van recombinant P4H als een van de oxygenases betrokken bij het fysiologisch metabolisme van gastheercellen, inclusief de cofactor, het co-substraat en de zuurstof. Bovendien, zonder een krachtige proline synthetische route in E. coli, zal de beschikbaarheid en het transport van substraat de transformatie ernstig beperken.