- Abstract
- 1. Inleiding
- 2. Materialen en Methoden
- 2.1. Proefpersonen
- 2.2. Bloedafname
- 2.3. Extractie van Perifere Bloed Mononucleaire Cellen (PBMC’s)
- 2.4. RNA-extractie en cDNA synthese
- 2.5.
- 2.6. Evaluatie van de Serum Biochemische Factoren
- 2.7. Analyse en Interpretatie van Resultaten
- 3. Resultaat
- 3.1. Resultaten van qRT-PCR
- 3.2. Evaluatie van genexpressie in PBMC
- 4. Discussie
- Conflict of Interests
- Acknowledgments
Abstract
ABCA1 en ABCG1 genen coderen voor de cholesterol transporter proteïnen die een sleutelrol spelen in de cholesterol en fosfolipiden homeostase. Deze studie had als doel de expressie van ABCA1 en ABCG1 genen te evalueren en te vergelijken bij patiënten met het metabool syndroom en gezonde individuen. Deze case-control studie werd uitgevoerd bij 36 patiënten met het metabool syndroom en eenzelfde aantal gezonde personen in Hamadan (westen van Iran) gedurende 2013-2014. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit mononucleaire cellen en gezuiverd met behulp van RNeasy Mini Kit kolom. De expressie van ABCA1 en ABCG1 genen werd uitgevoerd door qRT-PCR. Het lipidenprofiel en de nuchtere bloedglucose werden gemeten met colorimetrische procedures. ABCG1 expressie bij patiënten met het metabool syndroom was significant lager (ongeveer 75%) vergeleken met die van de controlegroep, terwijl er voor ABCA1 expressie geen significant verschil was tussen de twee onderzochte groepen. Vergelijking van andere parameters zoals HDL-C, FBS, BMI, tailleomtrek, en systolische en diastolische bloeddruk tussen patiënten met het metabool syndroom en gezonde personen toonde significante verschillen (). Afname van ABCG1 expressie bij patiënten met het metabool syndroom in vergelijking met gezonde individuen suggereert dat hyperglykemie, gerelateerde metabolieten, en hyperlipidemie over de transporter capaciteit resulteerde in verminderde expressie van ABCG1. Afwezigheid van een significante verandering in ABCA1 genexpressie tussen twee groepen kan wijzen op een verschillend regulatiemechanisme voor ABCA1 expressie.
1. Inleiding
Het metabool syndroom (MetS) wordt gedefinieerd als een set van onderling samenhangende risicofactoren van diabetes en hart- en vaatziekten (CVD) . Er zijn enkele criteria voor de klinische diagnose van het metabool syndroom, waaronder een verhoogde tailleomtrek (≥102 cm bij mannen en ≥88 cm bij vrouwen), verhoogde triglyceriden (≥150 mg/dL of 1.7 mmol/L), verlaagd high density lipoproteïne-cholesterol (HDL-C <40 mg/dL of 1,03 mmol/L bij mannen en <50 mg/dL of 1,3 mmol/L bij vrouwen), en verhoogde bloeddruk (≥130 mm Hg systolische bloeddruk of ≥85 mmHg diastolische bloeddruk) . De diagnose MetS kan worden gesteld door waarneming van drie van deze criteria. In de afgelopen jaren is de prevalentie van MetS wereldwijd toegenomen; in de Verenigde Staten van Amerika is deze echter gedaald van 25,5% in 1999/2000 tot 22,9% in 2009/2010 . Weiss en collega’s meldden dat zwaarlijvigheid direct geassocieerd is met een verhoogde prevalentie van MetS . Er is een omgekeerde associatie tussen CVD en plasma HDL-C niveau, één van de criteria van het metabool syndroom . High density lipoproteïne, een subfractie van circulatoire lipoproteïnen, speelt een belangrijke rol in het cholesteroltransport van perifeer weefsel naar levercellen . HDL is rijk aan Apo A-I en Apo A-II eiwitten, en meer dan tweederde van zijn inhoud is Apo A-I .
De ABC transmembraan transporters hebben een belangrijke rol in cholesterol opname van macrofaag naar HDL en verminderen de vorming van schuimcellen . ABCA1 bestaat uit 2261 aminozuren en komt in de meeste weefsels voor. In de afgelopen jaren is aangetoond dat ABCA1 een essentiële rol speelt bij de bescherming tegen hart- en vaatziekten. De HDL-synthese hangt rechtstreeks af van de ABCA1-activiteit in levercellen; met andere woorden, het heeft een sleutelfunctie in de bescherming van arteriële cellen tegen schuimcellen door verhoging van plasma-HDL. Arteriële macrofagen ABCA1 activiteit heeft aangetoond een omgekeerde associatie met schuimcelvorming, zoals met de toename van zijn activiteit de vorming van schuimcel zal verminderen.
De verminderde of verminderde ABCA1 activiteit zou kunnen leiden tot een aantal ziekten zoals type 2 diabetes , Tanger ziekte , en vroegtijdige CVD.
ABCG1 gen is gelegen op chromosoom 21q22.3 . Zowel ABCA1 als ABCG1 leiden tot vermindering van weefselcholesterol door zijn efflux naar HDL, maar ABCG1 transporteert weefselcholesterol naar HDL2 en HDL3 en ABCA1 transporteert het naar lipide-vrij Apo A-I . Macrofagen zijn het belangrijkste weefsel waar ABCA1 en ABCG1 werkzaam zijn . In vele studies werden de effecten van up- en downregulatie van deze genen onderzocht.
Een verminderde cholesterol efflux is het gevolg van een gebrek aan ABCA1 expressie in vitro ; het kan leiden tot een toename van atherosclerose , maar upregulatie van ABCA1 resulteert in een vermindering van atherosclerose . ABCG1 downregulatie heeft ook dezelfde effecten op cholesterol efflux maar er zijn controversiële resultaten over de impact van ABCG1 downregulatie op atherosclerose.
In MetS, veranderen de expressiepatronen van sommige genen en kunnen leiden tot obesitas, diabetes en hypertensie. In de huidige studie trachtten we de expressie van de ABCA1 en ABCG1 genen te evalueren bij patiënten met MetS, aangezien deze genen betrokken zijn bij de synthese van de transporters die een cruciale rol spelen in het cholesteroltransport.
2. Materialen en Methoden
2.1. Proefpersonen
Deze case-control studie werd uitgevoerd bij patiënten die gedurende 2013-2014 werden doorverwezen naar een endocrinologieafdeling in een ziekenhuis in Hamadan (westen van Iran). Zesendertig patiënten met het metabool syndroom werden geselecteerd. Ook werden 36 gezonde personen met dezelfde leeftijd en geslacht geselecteerd als controlegroep. Geen van de gezonde personen had de criteria van het metabool syndroom.
Het inclusiecriterium in de metabool syndroom groep was het hebben van drie van de vijf van de bovengenoemde kenmerken. De patiënten met een voorgeschiedenis van consumptie van antilipiden, anticonceptiva en diuretica werden uitgesloten van het onderzoek. De zwangere patiënten en de patiënten met diabetes, ontsteking, en besmetting werden ook uitgesloten.
2.2. Bloedafname
Een bloedmonster van 2,5 ml van elke proefpersoon werd toegevoegd aan een EDTA-bevattend buisje en werd bewaard bij 4°C voor RNA-extractie (niet meer dan twee uur later).
2.3. Extractie van Perifere Bloed Mononucleaire Cellen (PBMC’s)
Lymphodex (Duitsland) en Henx (Iran) oplossingen werden gebruikt voor de isolatie van PBMC’s. Ongeveer 2 mL Henx-oplossing werd toegevoegd aan een gelijk volume bloed en volledig gemengd; vervolgens werd het voorzichtig en langzaam op 3 mL Lymphodex-oplossing gegoten. Vervolgens werd het mengsel op de Lymphodex geplaatst en gedurende 20 minuten bij 1000 g gecentrifugeerd. De tussenliggende witte laag tussen het plasma en de Lymphodex werd geïsoleerd als mononucleaire cellen (MC’s); vervolgens werd de Henx-buffer aan de MC toegevoegd, volledig gemengd en gecentrifugeerd. Tenslotte werd het supernatant weggegooid en werd het proces nog een keer herhaald.
2.4. RNA-extractie en cDNA synthese
De netto-extractie van RNA werd uitgevoerd met behulp van de Gene JET RNA Purification kit volgens het protocol van de fabrikant. De kwaliteit en kwantiteit van het gezuiverde RNA werden geanalyseerd met behulp van NanoSpectrophotometer (Epoch, BioTek, USA); vervolgens werd de integriteit van elk RNA monster onderzocht met behulp van 1% agarose gel, 1x TBE.
Het RNA werd omgezet in cDNA met behulp van RevertAid First Strand cDNA Synthese Kit (K1622) door het volgen van het protocol: stap 1: primer annealing bij 25 ° C gedurende 5 min; stap 2: cDNA synthese bij 42 ° C gedurende 60 min; stap 3: warmte-inactivering bij 70 ° C gedurende 5 min. De producten werden bewaard bij -80°C voor de volgende stappen.
2.5.
De specifieke primers voor elk gen werden ontworpen door Allele ID software (versie 7.6). Om de specificiteit van de real-time PCR-reactie te verhogen en de vals-positieve resultaten te verminderen, werd van elk primerpaar één primer ontworpen om aan het Exon-Exon verbindingsgebied te worden gehecht. De grondige criteria van de gebruikte primers voor elk gen zijn vermeld in tabel 1. Het 18S rRNA-huishoudgen werd als interne controle gebruikt.
|
De relatieve expressie van de genen werd berekend door het meten van de drempelwaarde van de cyclus (CT) voor elk monster met behulp van de C1000 Thermocycler en het CFX96 real-time systeem (Bio-Rad, USA) en de SYBR Premix Ex Taq 2 Kit (TakaRa No. RR820L). Het gemiddelde van CT in drievoud van elk monster werd bepaald als CT-waarde. De ingrediënten van qRT-PCR-reactie omvatten 10 pi SYBR-groen, 7 pi gedeïoniseerd water, en 1 pi van elk van de forward primer, reverse primer, en template. qRT-PCR werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: initiële activering bij 95°C gedurende 30 sec en vervolgens 40 cycli van de volgende stappen herhaald: denaturatie bij 95°C gedurende 5 sec, annealing bij geoptimaliseerde annealingtemperatuur voor de juiste duur van elk gen, en extensie bij 72°C gedurende 30 sec, en aan het eind werden de gegevens verkregen door de temperatuur te verhogen van 72°C tot 95°C gedurende 0,5°C/0,05 sec. Daarna werden de PCR-producten geëlektroforeerd (op 1% agarose gel, 1x TBE) om de specificiteit van de amplicons te verifiëren.
2.6. Evaluatie van de Serum Biochemische Factoren
Een twee-milliliter bloedmonster werd afgenomen van elke proefpersoon en gecentrifugeerd bij 3000 rpm gedurende 10 min voor serum scheiding. Totaal cholesterol (TC), LDL-C, TG, FBS, en HDL-C werden onderzocht met behulp van Pars Azmun (Iran) kit door Hitachi 911 (Duitsland).
2.7. Analyse en Interpretatie van Resultaten
formule werd gebruikt voor de analyse van de relatieve genexpressie van metabool syndroom en controlegroepen. De efficiëntie van real-time PCR werd berekend voor elk gen door gebruik te maken van 10-2 verdunning; vervolgens werd het verkregen getal geplaatst op de volgende rekenformule voor het meten van de vouwveranderingen van genexpressie :SPSS V.16 software werd gebruikt voor statistische analyse met 95% betrouwbaarheidsintervallen. Normale distributie van de variabelen werd gecontroleerd door Kolmogorov-Smirnov methode en vervolgens werden de waarden vergeleken tussen twee groepen via onafhankelijke monsters -test.
3. Resultaat
Demografische kenmerken en biochemische factoren van de bestudeerde groepen worden gepresenteerd in tabel 2. De man/vrouw verhouding was 1/3 in elke groep (12 M en 24 F). Zoals blijkt uit tabel 2, waren de verschillen in alle onderzochte parameters statistisch significant tussen de twee groepen () met uitzondering van leeftijd en LDL-C. De metabool syndroom groep had een hogere BMI, LDL-C, TC, TG, FBS, diastolische/diastolische bloeddruk, en omtrek taille in vergelijking met gezonde personen, terwijl HDL-C significant lager was bij het metabool syndroom.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BMI: Body Mass Index; FBS: Fast Blood Sugar; TG: triglyceride, HDL-C: hoge dichtheid lipoproteïne-cholesterol; LDL-C: lage dichtheid lipoproteïne-cholesterol; significant verschil. |
3.1. Resultaten van qRT-PCR
Na voltooiing van de PCR-reactie werden de resultaten geverifieerd door analyse van de reactiecurve, de smeltcurve van de producten, en elektroforese van de PCR-producten. De elektroforese werd uitgevoerd op 1% agarose met gebruikmaking van een DNA-ladder van 100 bp. De resultaten zijn weergegeven in figuur 1.
3.2. Evaluatie van genexpressie in PBMC
De expressieniveaus van de genen werden gemeten in de mononucleaire cellen van het perifere bloed en vergeleken tussen twee groepen door berekening van ΔCT voor elk gen. Er was geen verschil in ABCA1 expressie tussen twee groepen maar ABCG1 expressie was significant lager in de MetS groep (). De gedetailleerde resultaten zijn weergegeven in tabel 3.
|
||||||||||||||||||||||||||
Significant. |
Ook de berekening van de vouwverandering in ABCG1 expressie () gaf 3.1 voudig lagere expressie aan in de MetS groep.
4. Discussie
ABCA1 en ABCG1 hebben een cruciale rol in het omgekeerde cholesterol transport van perifere weefsels zoals macrofagen naar de lever . De expressie van ABCA1 en ABCG1 genen is echter bestudeerd bij sommige ziekten; vonden we geen enkel rapport over dit onderwerp bij het metabool syndroom. In deze studie onderzochten we de expressie van deze genen bij personen met het metabool syndroom en gezonde personen.
Terwijl er geen significant verschil was in ABCA1 genexpressie tussen de twee bestudeerde groepen, vonden we een significant lagere expressie (ongeveer 75%) van ABCG1 bij personen met het metabool syndroom in vergelijking met de controlegroep. Singaraja et al. toonden aan dat de verminderde ABCA1 in macrofagen en nieren geassocieerd is met een verhoogd cholesterolgehalte . Zij concludeerden dat een verminderde ABCA1-gemedieerde cholesterolexport zou kunnen bijdragen aan de toegenomen atherosclerose en nefropathie geassocieerd met diabetes. Er zijn enkele rapporten die trachten de mogelijke mechanismen te onderzoeken die de expressie van deze genen reguleren. Onlangs is aangetoond dat polymorfismen in ABCA1 en ABCC8 in verband kunnen worden gebracht met het metabool syndroom. Er zijn aanwijzingen dat een verstoring van de werking van ABCA1, die het gevolg kan zijn van een mutatie in dit gen, kan leiden tot familiaire hypoalfalipoproteïnemie, die wordt gekenmerkt door een laag HDL en een verhoogde afzetting van cholesterylesters in verschillende weefsels en cellen. Er is ook aangetoond dat overexpressie van het ABCA1-gen bescherming kan bieden tegen atherosclerose. Deze gegevens komen overeen met onze bevindingen en ondersteunen het idee dat een lagere expressie van het ABCA1-gen kan bijdragen aan de complicaties van het metabool syndroom.
Haghpassand et al. toonden aan dat de expressie van het ABCA1-gen in PBMC’s rechtstreeks verband houdt met de cholesterolbelasting, en overexpressie van ABCA1 leidt tot overdracht van het teveel aan cholesterol naar de apoproteïnen. Wang et al. onderzochten het omgekeerde cholesterol transport in ABCA1 en ABCG1 knockdown muizen en concludeerden dat wanneer zowel ABCA1 als ABCG1 werden knockdown, er een groter omgekeerd cholesterol transport is vergeleken met ABCG1 knockdown.
Aangezien Mauerer et al. erop wezen dat het hoge glucose niveau (hyperglycemie) betrokken is bij verminderde ABCA1 en ABCG1 expressie in vitro , lijkt het logisch om gelijkaardige veranderingen te verwachten in MetS. Promotors van ABCA1 en ABCG1 hebben receptor sites voor LXR en RXR; wanneer oxycholesterol en retinoïnezuur zich bij deze factoren voegen, wordt de expressie van ABCA1 en ABCG1 verhoogd. Ook zijn cAMP en NFκB transcriptiefactoren voor respectievelijk ABCA1 en ABCG1.
De verkregen resultaten wezen op een significante afname van ABCG1 expressie bij patiënten met het metabool syndroom in vergelijking met gezonde personen. Deze resultaten suggereren dat hyperglykemie, gerelateerde metabolieten, en hyperlipidemie over de transporter capaciteit kunnen leiden tot verminderde expressie van ABCG1. Omdat er geen significante verandering werd waargenomen in ABCA1 genexpressie, kan dit te wijten zijn aan een verschillend regulatiemechanisme. Aangezien de structuren van deze genen verschillend zijn en ze gereguleerd worden door verschillende transcriptionele factoren, kunnen onze resultaten verantwoord worden. Niettemin is het beperkte aantal monsters in deze studie een andere factor voor de afwezigheid van veranderingen in ABCA1 expressie.
Het andere punt is dat we de expressie van deze genen in PBMC van de bestudeerde proefpersonen hebben onderzocht; het is belangrijk op te merken dat de veranderingen in de expressie van deze genen in monocyten anders kunnen zijn dan die in de andere belangrijke weefsels zoals lever en darm, die de belangrijkste plaatsen van HDL synthese zijn. Bovendien impliceren de veranderingen in mRNA-niveaus niet noodzakelijk veranderingen in het verwante eiwit.
Conflict of Interests
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is.
Acknowledgments
Dit artikel is ontleend aan het M.S. proefschrift van Zahra Tavoosi. De auteurs willen graag Hamadan University of Medical Sciences bedanken voor de financiële ondersteuning van deze studie.