Weliswaar worden proteïne-assays op verschillende manieren gebruikt in biowetenschappelijk onderzoek, maar er is niet één assay-methode die geschikt is voor alle toepassingen. Ondanks alle vooruitgang in de moderne wetenschap bestaat er geen eiwitbeproevingsmethode die niet wordt beïnvloed door niet-eiwitcomponenten of door verschillen in eiwitsamenstelling. Om deze reden vinden eiwitlaboratoria het noodzakelijk om meer dan één type eiwitassay te hebben voor onderzoekstoepassingen.
Elke assay heeft zijn eigen voordelen en beperkingen. Dus, als je wilt nauwkeurige resultaten van uw experiment te krijgen, moet u in staat zijn om de meest geschikte assay voor uw toepassing te selecteren.
Types van colorimetrische Eiwit Assays
Gebaseerd op de betrokken chemie, de twee meest voorkomende methoden voor de colorimetrische detectie en kwantificering van totaal eiwit zijn de eiwit-kleurstof bindende assay en / of koper-ion-gebaseerde chelatie assay.
Dye Binding Assays
Dye-binding assays, zoals de Bradford (Coomassie) en 660nm eiwit assays, zijn gebaseerd op de binding van eiwitmoleculen aan Coomassie kleurstof onder zure omstandigheden. Zodra de eiwitmoleculen zich aan de kleurstof binden, verschuift de kleur van bruin (Amax= 465nm) naar blauw (Amax= 610nm). De verandering in kleurdichtheid (die wordt afgelezen bij 595nm) is evenredig met de eiwitconcentratie.
De basische aminozuren (arginine, lysine en histidine) spelen een vitale rol bij de vorming van kleurstof-eiwitcomplexen en de resulterende spectrale verschuiving, terwijl kleinere eiwitten (minder dan 3kDa) en aminozuren geen kleurveranderingen veroorzaken.
Copper Ion Based Assays
In copper ion based protein assays wordt de eiwitoplossing gemengd met een alkalische oplossing van koperzout om de chelatie van koperionen (Cu2+) met de peptidebindingen te vergemakkelijken, en de daaropvolgende reductie van de koperionen (Cu2+) tot koperionen (Cu+). Overtollige koperionen blijven ongebonden aan de peptidebindingen en zijn beschikbaar voor detectie.
Proteïnebepalingen op basis van koperionen kunnen in twee groepen worden verdeeld – (1) bepalingen die gereduceerde koperionen (Cu+) detecteren en (2) bepalingen die ongebonden koperionen (Cu2+) detecteren. Bicinchoninezuur (BCA) of Folin-reagens (fosfomolybdeen/fosfotungsteenzuur) kunnen worden gebruikt voor de detectie van koper-ionen. Bij de reductie van het gebruikte reagens ontstaat een blauwe kleur. De hoeveelheid geproduceerde kleur kan worden afgelezen bij 650nm tot 750nm en is evenredig met de hoeveelheid peptidebindingen.
Noot: De aanwezigheid van tyrosine, tryptofaan, cysteïne, histidine en asparginine in eiwitten verhoogt de resulterende kleurdichtheid.
In assays op basis van de detectie van ongebonden koperionen wordt alkalisch koper gemengd met de eiwitoplossing en de ongebonden koperionen worden vervolgens gedetecteerd met een kleurproducerend reagens dat reageert met koperionen. De hoeveelheid geproduceerde kleur is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid peptidebinding in het monster.
Eiwit Assays selecteren: Some Factors to Consider
Er zijn een aantal factoren die u moet overwegen bij het kiezen van een assay. Hier zijn enkele van hen.
- Compatibiliteit met het monstertype en de componenten. De aard van het eiwitmonster en de aanwezigheid van niet-eiwitmiddelen in eiwitoplossingen kunnen de resultaten van uw experiment aanzienlijk beïnvloeden. Houd er rekening mee dat de aanwezigheid van reductiemiddelen, metaal chelaatvormers, kleurstoffen, amines en suikers interfereren met koper gebaseerde eiwit assays, terwijl eiwitoplossingen die detergenten bevatten interfereren met de kleurstof gebaseerde eiwit assays.
- Assay bereik en vereiste monstervolume. De meeste colorimetrische bepalingen vereisen ten minste 0,5 µg eiwitten voor een betrouwbare schatting. Dus, voor moeilijk te verkrijgen monsters, methoden die de minste hoeveelheid monster nodig voor een betrouwbare schatting moet worden overwogen.
- Eiwit-to-eiwit uniformiteit. Op kleurstof gebaseerde eiwitbepalingen en bepalingen waarbij koper-ionen tot koper-ionen worden gereduceerd, vertonen een aanzienlijke variatie van eiwit tot eiwit.
- Tijdsoverwegingen. De complexiteit van het monster en de gekozen assay-methode dicteren de hoeveelheid tijd die u nodig hebt om uw eiwit assay uit te voeren. Eiwitmonsters die storende stoffen bevatten en assays die standaardplots of -curven gebruiken, zullen meer tijd in beslag nemen.
- Vereisten voor instrumentatie. De beschikbaarheid van spectrofotometer of plaatlezer die nodig is om de door de assay geproduceerde kleur (extinctie) te meten, kan ook van invloed zijn op uw keuze.
