Diagnostic power of laboratory tests for hereditary spherocytosis: a comparison study in 150 patients grouped according to molecular and clinical characteristics

Abstract

Achtergrond De laboratoriumdiagnose van hereditaire sferocytose berust gewoonlijk op op NaCl gebaseerde of op glycerol gebaseerde osmose-fragiliteitstests voor rode cellen; meer recentelijk is een test voorgesteld die direct gericht is op het moleculaire defect van hereditaire sferocytose (eosine-5′-maleïmide-bindingstest). Geen van de beschikbare tests identificeert alle gevallen van erfelijke sferocytose.Design en Methoden Wij vergeleken de prestaties van de eosine-5′-maleïmide-bindingstest, NaCl-osmotische kwetsbaarheidsstudies op vers en geïncubeerd bloed, de glycerollysistest, de aangezuurde glycerollysistest, en de Pink-test op een serie van 150 patiënten met hereditaire sferocytose gegroepeerd volgens klinisch fenotype en het defecte eiwit, met het uiteindelijke doel de combinatie van tests te vinden die geassocieerd wordt met het hoogste diagnostische vermogen, zelfs in de mildste gevallen van hereditaire sferocytose.Resultaten De eosine-5′-maleïmide-bindingstest had een sensitiviteit van 93% en een specificiteit van 98% voor het opsporen van erfelijke sferocytose: de sensitiviteit was onafhankelijk van het type en de hoeveelheid van het moleculaire defect en van het klinische fenotype. De aangezuurde glycerollysetest en de Pink-test vertoonden een vergelijkbare gevoeligheid (95% en 91%). De gevoeligheid van de NaCl-osmotische kwetsbaarheidstest, die algemeen als de gouden standaard voor de diagnose van erfelijke sferocytose wordt beschouwd, bedroeg 68% op vers bloed en 81% op geïncubeerd bloed, en nam verder af bij gecompenseerde gevallen (respectievelijk 53% en 64%). Met de combinatie van de eosine-5′-maleïmide-bindingstest en de aangezuurde glycerollysetest konden alle patiënten met erfelijke sferocytose worden geïdentificeerd. De eosine-5′-maleimide-bindingstest toonde de grootste ziektespecificiteit.Conclusies Elk type test faalt bij de diagnose van sommige gevallen van hereditaire sferocytose. De combinatie van een eosine-5′-maleïmide-bindingstest en een aangezuurde glycerollysetest maakte identificatie van alle patiënten met hereditaire sferocytose in deze serie mogelijk en vormt daarom een momenteel effectieve diagnostische strategie voor hereditaire sferocytose, inclusief milde/gecompenseerde gevallen.

Inleiding

Hereditaire sferocytose is de meest voorkomende congenitale hemolytische anemie bij Kaukasiërs, waarbij ongeveer 1 op de 1000-2000 individuen voorkomt.1,2 Het moleculaire defect is zeer heterogeen en betreft de genen die coderen voor spectrine, ankyrine, band 3 en proteïne 4.2,3 en de mate van hemolyse varieert sterk, van volledig gecompenseerd tot transfusie-afhankelijke anemie.

Het typische laboratoriumkenmerk van erfelijke sferocytose, hoewel niet specifiek, is de aanwezigheid van sferocyten op een perifeer bloeduitstrijkje, die bij 97% van de patiënten aantoonbaar zijn.4 Bij sommige patiënten kunnen er echter zeer weinig sferocyten zijn4,5 en daarom zijn deskundige operatoren nodig om ze op te sporen; bovendien wordt microscopisch onderzoek van rode cellen in het tijdperk van laboratoriumautomatisering steeds vaker achterwege gelaten. De laboratoriumdiagnose van erfelijke sferocytose berust daarom meestal op tests die gebruik maken van de verhouding tussen oppervlakte en volume, die bij sferische erytrocyten meestal kleiner is, met name osmotische kwetsbaarheidstests van rode cellen bij verschillende natriumchloride (NaCl)-concentraties op vers en geïncubeerd bloed,6 en tests die de mate of de snelheid meten van de lysis van rode cellen die in gebufferde glyceroloplossingen zijn gesuspendeerd, d.w.z. de glycerollysesnelheid van rode cellen die in gebufferde glyceroloplossingen zijn gesuspendeerd.De glycerollysetest (GLT)7 , de aangezuurde glycerollysetest (AGLT)8 en de Roze test9 . Deze tests pikken echter een variabel deel van de gevallen van erfelijke sferocytose niet op, vooral de mildste niet,6,10-12 en maken geen onderscheid tussen erfelijke sferocytose en secundaire sferocytose die geassocieerd is met andere aandoeningen, voornamelijk auto-immuun hemolytische anemieën.13-15

Meer recentelijk zijn de cryohemolyse-test,16,17 gebaseerd op de waarneming dat rode cellen van patiënten met erfelijke sferocytose bijzonder gevoelig zijn voor koeling bij 0° C in hypertonische omstandigheden, en de flowcytometrische analyse van eosine-5′-maleïmide-gelabelde intacte rode bloedcellen (EMA-bindingstest)18 voorgesteld als nieuwe methoden voor het identificeren van erfelijke sferocytose.19 Met name de EMA-bindingstest is een gevoelige en specifieke diagnostische test voor hereditaire sferocytose gebleken12,18,20-29 die direct gericht is op de structurele laesie van deze ziekte, aangezien de fluorescente probe, eosine-5′-maleïmide, een wisselwerking aangaat met het eiwitband-3-complex.30

De prestaties van de beschikbare directe of indirecte diagnostische tests zijn meestal individueel en op een beperkt aantal gevallen geëvalueerd. De gevoeligheid van de test varieert sterk en elke methode slaagt er niet in verschillende patiënten met hereditaire sferocytose te identificeren.4,6,12 In deze studie hebben wij de prestaties van EMA-binding, NaCl-geïnduceerde osmotische kwetsbaarheid van vers en geïncubeerd bloed, GLT, AGLT en Pink-testen vergeleken bij een serie van 150 patiënten met hereditaire sferocytose gegroepeerd volgens het klinische fenotype en de moleculaire laesie, met als uiteindelijk doel de combinatie van testen te vinden die geassocieerd is met het hoogste diagnostische vermogen voor hereditaire sferocytose, inclusief de mildste gevallen die gewoonlijk moeilijk te diagnosticeren zijn.

Ontwerp en Methoden

Onderwerpen

Honderdvijftig opeenvolgende patiënten met hereditaire sferocytose (79 mannen en 71 vrouwen, mediane leeftijd 26 jaar, range 0-79 jaar) behorend tot 128 niet-verwante families werden onderzocht. Ten tijde van het onderzoek waren 22 patiënten gesplenectomiseerd en 128 niet.

Alle patiënten ondergingen een klinische en lichamelijke evaluatie en de volgende laboratoriumonderzoeken: volledig bloedbeeld, bloeduitstrijkjesonderzoek, reticulocytengetal, bepaling van de bilirubine- en haptoglobineconcentratie, beoordeling van de ijzerstatus, directe antiglobulinetest (DAT), screening op abnormale of instabiele hemoglobines, NaCl osmotische kwetsbaarheidstest op vers en geïncubeerd bloed, GLT, AGLT, Pink-test en EMA-bindingstest. In sommige gevallen werd de activiteit van de belangrijkste enzymen van de glycolytische en pentosefosfaatroute onderzocht. Bij enkele patiënten werd ook de mitogeen gestimuleerde DAT31 uitgevoerd om de diagnose van DAT-negatieve hemolytische anemie uit te sluiten.

Hereditaire sferocytose werd gediagnosticeerd op basis van klinische en laboratoriumverschijnselen van chronische hemolyse, aanwezigheid van sferocyten bij perifeer bloeduitstrijkonderzoek, positiviteit van ten minste één rode-celfragiliteitstest, eventuele familieanamnese van erfelijke sferocytose, en uitsluiting van andere oorzaken van secundaire sferocytose.19 Anemie werd gedefinieerd als ernstig (Hb<8 g/dL), matig (Hb 8-10 g/dL), mild (Hb>10 en <11,5 g/dL voor vrouwen en Hb>10 en <13,5 g/dL voor mannen) en gecompenseerd (Hb>11,5 g/dL voor vrouwen en >13,5 g/dL voor mannen).

Stalen van alle patiënten werden onderworpen aan natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelectroforese (SDS-PAGE) voor analyse van de rode celmembraanproteïnen en verdeeld naargelang er sprake was van deficiëntie van band 3, spectrine of ankyrine, gecombineerde spectrine/ankyrine-deficiëntie, en geen detecteerbaar defect.4

Vijfhonderdvijfenzeventig gezonde bloeddonors en 84 gevallen met hemolytische anemie anders dan erfelijke sferocytose (17 met auto-immuun hemolytische anemie, 10 met rode celenzymstoornissen, 10 met erfelijke elliptocytose, 15 met congenitale dyserythropoiëtische anemie, 9 met paroxysmale nachtelijke hemoglobinurie, 3 met stomatocytose, 3 met mechanische anemie, en 17 met anemie van onbekende oorzaak) werden ook bestudeerd.

Hematologische bepalingen

Perifeer bloed werd verzameld van patiënten en controles tijdens diagnostische procedures na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming en goedkeuring van het Institutional Human Research Committee. De gevolgde procedures waren in overeenstemming met de internationale ethische normen van Helsinki inzake experimenten op de mens. Het merendeel van de monsters werd in ons instituut verzameld; monsters uit andere centra werden verzonden bij een temperatuur van 4°C en altijd binnen 24 uur verwerkt. Geen van de patiënten had een transfusie ondergaan in de 3 maanden voorafgaand aan het onderzoek. Hematologische parameters werden bepaald op een geautomatiseerde hematologieanalysator (automatische Beckman Coulter LH-750, CA, USA). Routine hematologische onderzoeken werden uitgevoerd volgens Dacie & Lewis.32 Bilirubine, haptoglobine, en ferritine niveaus werden bepaald met Integra 800 (Roche, Mannheim, Duitsland). Het aantal sferocyten in het perifere bloed werd beoordeeld door twee onafhankelijke en deskundige operatoren. De osmotische kwetsbaarheid van de rode bloedcellen werd geëvalueerd door de NaCl osmotische kwetsbaarheidstest uit te voeren op zowel vers als geïncubeerd bloed,6 de standaard GLT,7 de AGLT8 en de Pink test9 op monsters van elke patiënt.

De EMA-bindingstest werd uitgevoerd zoals beschreven door King et al.18 met kleine modificaties. Met name werd de fluorescentie-intensiteit, uitgedrukt als mediane kanaalfluorescentie, bepaald voor 10.000 events in het FL-1-kanaal, met behulp van een Becton Dickinson FACSCanto II flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, VS). De voorraadoplossing van de EMA-kleurstof werd in kleine aliquots bij -80° C bewaard gedurende een periode van 6 maanden. De test werd eenmaal per week uitgevoerd, waarbij alle gevallen op dezelfde dag werden gegroepeerd25 nadat de reproduceerbaarheid van de resultaten op bloedmonsters die tot 6 dagen bij 4°C waren bewaard, was bevestigd.

Om de intra-test variatie te verminderen, werden de monsters van de patiënten vergeleken met die van zes normale controles. De resultaten werden uitgedrukt als het percentage fluorescentievermindering van het monster van de patiënt in vergelijking met de gemiddelde fluorescentie van de zes normale controles, zoals voorgesteld door Girodon et al.25 Een ontvanger-operationele karakteristiek (ROC)-curve op basis van logistische regressieanalyse werd gebruikt om de optimale cut-off tussen de waarden van patiënten met hereditaire sferocytose en die van normale personen te bepalen. Volgens de analyse van de ROC-curve was de optimale afname in fluorescentie om normale personen te scheiden van patiënten met hereditaire sferocytose 11%. Onder deze omstandigheden was de specificiteit van de test berekend op 575 gezonde personen 98%.

Roodcel ghosts werden binnen 24 uur na de bloedafname bereid volgens de methode beschreven door Dodge et al.33 met kleine wijzigingen.4 Eiwitten van het rode celmembraan werden binnen 15 dagen na de bereiding van de ghosts geanalyseerd door SDS-PAGE met een acrylamide gradiënt van 4% tot 12% volgens Fairbanks et al.34 en het discontinue buffersysteem van Laemmli35 met een acrylamide lineaire gradiënt van 6% tot 14%, zoals eerder beschreven.4 De activiteiten van enzymen van de glycolytische en pentosefosfaatroutes werden bepaald volgens de methoden beschreven door Beutler.36

Resultaten

Tabel 1 toont de hematologische en biochemische gegevens van de patiënten met hereditaire sferocytose, gegroepeerd volgens het feit of zij vóór het tijdstip van de studie niet of wel gesplenectomeerd waren, en volgens het klinische fenotype (alleen bij niet-gesplenectomiseerde patiënten). De meerderheid van de niet gesplenectomiseerde patiënten had een milde tot gecompenseerde hemolyse; 18% had zeer weinig sferocyten (≤3%). De meest voorkomende eiwitafwijkingen waren spectrine en band 3 deficiënties bij zowel de niet-gesplenectomiseerde als de gesplenectomiseerde patiënten. Het membraaneiwitdefect was niet aantoonbaar bij negen (7%) niet-gesplenectomiseerde personen, van wie zeven een positieve familieanamnese van erfelijke sferocytose hadden; de resterende twee vertoonden milde anemie, reticulocytose en 5% sferocyten, in afwezigheid van andere oorzaken van chronische hemolytische anemie.

Tabel 2 vergelijkt de gevoeligheid van de diagnostische laboratoriumtesten voor erfelijke sferocytose. EMA-binding slaagde er niet in 10/150 (7%) gevallen te identificeren (4 met band 3 deficiëntie, 5 met spectrine deficiëntie en 1 met een niet gedetecteerd defect). De gemiddelde afname van de fluorescentie was 27% ± 10% bij patiënten met erfelijke sferocytose tegenover 0% ± 8% bij referentiepatiënten (P<0,001). De procentuele afname van de fluorescentie was direct gerelateerd aan het aantal sferocyten en indirect aan het gemiddelde corpusculaire volume; er werd geen correlatie gevonden met de hemoglobineconcentratie, het absolute aantal reticulocyten of de breedte van de rode celverdeling. De gevoeligheid van de test was onafhankelijk van het type en de hoeveelheid van het moleculaire defect, hoewel deze iets lager was bij patiënten met onopgemerkte defecten die de kleinste mediane afname in fluorescentie hadden (15% versus 30% en 28% bij respectievelijk band 3 en spectrine deficiëntie). Het is vermeldenswaard dat de gevoeligheid van de EMA-bindingstest iets hoger was bij gesplenectomiseerde dan bij niet-gesplenectomiseerde patiënten (figuur 1).

De gevoeligheid van de verschillende onderzochte tests voor de breekbaarheid van rode cellen was zeer variabel en over het algemeen hoger bij gesplenectomiseerde dan bij niet-gesplenectomiseerde hereditaire sferocytose, en lager (met uitzondering van AGLT) bij de patiënten met niet-gedetecteerde defecten dan bij die met detecteerbare defecten (tabel 2A). Wat de NaCl osmotische kwetsbaarheidstest betreft, was de gevoeligheid groter wanneer deze werd uitgevoerd op geïncubeerd bloed dan op vers bloed. In het algemeen hadden de NaCl-osmotische kwetsbaarheidstests (zowel op vers als op geïncubeerd bloed) een lagere gevoeligheid dan de meer algemeen gebruikte tests op basis van glycerol. Van deze laatste tests had AGLT de hoogste gevoeligheid, ook in de gevallen met niet-gedetecteerde defecten, vergelijkbaar met die van de EMA-bindingstest.

Tabel 1.Hematologische en biochemische gegevens van patiënten met hereditaire sferocytose, gegroepeerd naar het al dan niet ondergaan van splenectomie.

Alle patiënten met hereditaire sferocytose waren positief op ten minste twee verschillende tests, met uitzondering van twee patiënten (1 met band 3-deficiëntie en 1 met spectrinedeficiëntie) die alleen positief waren op de EMA-bindingstest. Wij vonden dat de combinatie van EMA en AGLT de identificatie van alle patiënten met erfelijke sferocytose mogelijk maakte (Tabel 2B). In het bijzonder waren 133/150 (88%) van de gevallen van hereditaire sferocytose EMA-positief, AGLT-positief, 7/150 (5%) waren EMA-positief, AGLT-negatief en 10/150 (7%) waren EMA-negatief, AGLT-positief.

Wanneer de prestatie van de verschillende testen werd geanalyseerd bij niet gesplenectomiseerde patiënten als functie van het klinische fenotype, behielden EMA-binding, de AGLT en de Pink-test een hoge gevoeligheid in de verschillende klinische subsets, terwijl de gevoeligheid van de NaCl osmotische fragiliteitstest op vers bloed en na incubatie duidelijk daalde in gecompenseerde gevallen (figuur 1).

De resultaten van verschillende tests bij een serie van 84 patiënten met andere hemolytische aandoeningen dan erfelijke sferocytose zijn afgebeeld in figuur 2. EMA-binding vertoonde de grootste ziektespecificiteit en was negatief bij alle patiënten met auto-immuun hemolytische anemie, zelfs in aanwezigheid van uitgesproken sferocytose.

Discussie

Dit is de eerste uitgebreide vergelijkende studie van de momenteel meest gebruikte laboratoriummethoden voor de diagnose van erfelijke sferocytose, uitgevoerd bij een groot aantal patiënten, gegroepeerd volgens het moleculaire defect, de graad van hemolyse en de aan- of afwezigheid van de milt. De vaststelling dat de helft van de onderzochte patiënten een milde/gecompenseerde anemie had en dus moeilijker te diagnosticeren was, en dat 18% zeer weinig sferocyten had op een perifeer bloeduitstrijkje, maakt de onderzochte populatie bijzonder geschikt voor gevoeligheidsstudies. Wij hebben de cryohemolyse test17 niet in deze studie opgenomen omdat de basis van de gevoeligheid van rode bloedcellen voor koeling van erfelijke sferocytose tot nu toe niet is opgehelderd, en de meningen over het routinematige gebruik ervan voor de diagnose van erfelijke sferocytose controversieel zijn.4,5,16,17,19,37,38

Tabel 2. (A) Gevoeligheid van afzonderlijke tests bij patiënten met hereditaire sferocytose (HS), gegroepeerd volgens het biochemisch defect. (B) De gevoeligheid van gecombineerde tests in het totaal van HS gevallen. Het getal geeft de verhouding positieve gevallen/totale gevallen weer, met percentuele waarden tussen haakjes.

Figuur 1.Gevoeligheid van verschillende diagnostische tests bij 22 gesplenectomiseerde en 128 nietgesplenectomiseerde patiënten met hereditaire sferocytose (HS). Niet-gesplenectomiseerde patiënten met HS werden ingedeeld volgens klinisch fenotype.

Van de beschouwde diagnostische methoden is de recent voorgestelde EMA-bindingstest zeker de meest interessante, en deze wordt steeds meer gebruikt door gespecialiseerde laboratoria vanwege de hoge gevoeligheid en specificiteit.12,18,23-29 Deze methode is rechtstreeks gericht op het structurele letsel van de ziekte, aangezien de fluorescente probe eosine-5′-maleïmide interageert met de transmembraaneiwitten band 3, Rh-eiwit, Rh-glycoproteïne en CD47, die verlaagd zijn in rode cellen van patiënten met erfelijke sferocytose;30 defecten van andere cytoskelet-eiwitten, zoals spectrine en proteïne 4.2, veroorzaken ook een afname van de fluorescentie-intensiteit, waarschijnlijk omdat ze een modulatie-effect over lange afstand veroorzaken op de bindingsplaats van de kleurstof in band 3-eiwit.39 De gevoeligheid van de EMA-bindingstest in deze serie is hoger dan die welke onlangs door Crisp e.a. werd gerapporteerd,12 en vergelijkbaar met die welke door anderen werd gevonden;18,23-29 bovendien blijkt de prestatie van de test onafhankelijk te zijn van het type rode celmembraaneiwittekort, en neemt slechts in geringe mate af bij hereditaire sferocytosepatiënten met een niet-detecteerbaar defect, in overeenstemming met wat werd waargenomen door King e.a.,18 en Girodon e.a..25 Interessant is dat de gevoeligheid onafhankelijk is van het klinische fenotype, en ook hoog is bij patiënten met gecompenseerde anemie. De afzonderlijke analyse van niet-gesplenectomiseerde en gesplenectomiseerde patiënten met erfelijke sferocytose toonde aan dat de gevoeligheid in de laatste groep toenam, een bevinding die in het algemeen voor alle onderzochte tests geldt; deze waarneming wijst op de noodzaak de klinische kenmerken van patiënten nauwkeurig te definiëren bij het testen van de prestaties van diagnostische methoden voor erfelijke sferocytose, en de analyse eventueel te beperken tot niet-gesplenectomiseerde personen. Een ander voordeel van de EMA-bindingstest is dat de resultaten niet worden beïnvloed door verzending of opslag gedurende maximaal 6 dagen, zoals blijkt uit figuur 3, waardoor verzending van monsters mogelijk is, zoals gerapporteerd door Girodon et al.25 Bovendien worden de resultaten niet beïnvloed door recente transfusies, aangezien de methode verschillende rode celpopulaties discrimineert.20

Figuur 2.Resultaten van afzonderlijke diagnostische tests bij patiënten met andere hemolytische anemieën dan hereditaire sferocytose (HS), vergeleken met die met HS. Het gearceerde gebied geeft de normale referentie-intervallen weer. CDA: congenitale dyserythropoiëtische anemie; AIHA: auto-immuun hemolytische anemie; HE: erfelijke elliptocytose; PNH: paroxysmale nachtelijke hemoglobinurie

Wat de NaCl-osmotische kwetsbaarheidstests betreft, stelden we vast dat deze er niet in slaagden bijna een kwart van de patiënten met erfelijke sferocytose te identificeren, wat de resultaten van andere onderzoekers bevestigt,12,13,19,40,41 en dat hun gevoeligheid over het algemeen lager was dan die van de andere diagnostische laboratoriumtests die in deze reeks werden geëvalueerd. Desondanks wordt geïncubeerde NaCl osmotische kwetsbaarheid nog steeds algemeen beschouwd als de gouden standaard voor het stellen van de diagnose van erfelijke sferocytose bij patiënten met Coombs-negatieve hemolytische anemieën.5,11,42 Uit de analyse van de literatuur blijkt inderdaad dat er in het verleden geen systematische studies naar de gevoeligheid van deze test zijn verricht en dat de bewering dat dit de beste methode is voor de diagnose van erfelijke sferocytose gebaseerd is op studies die zijn uitgevoerd bij een beperkt aantal patiënten met niet duidelijk gedefinieerde klinische kenmerken; bovendien kan de interpretatie van de osmotische fragiliteitscurven van NaCl in minder typische gevallen moeilijk zijn.8 Het grote aantal patiënten dat in deze serie werd onderzocht, stelde ons in staat de prestatie van de NaCl-osmotische kwetsbaarheidstest te correleren met de klinische expressie van de ziekte: de waarneming dat in gevallen van gecompenseerde hereditaire sferocytose de gevoeligheid van de osmotische kwetsbaarheidstest daalde tot bijna 60%, veel meer dan gerapporteerd door Korones & Pearson,13 beperkt verder het nut van deze methode in de mildste en minder typische gevallen. Dit wordt ook bevestigd door de bevinding dat de gevoeligheid daalt tot 30% bij patiënten met erfelijke sferocytose met een niet aantoonbaar biochemisch defect.

De op glycerol gebaseerde rode-celfragiliteitstests, met uitzondering van de oorspronkelijke versie GLT, zijn gevoeliger dan de NaCl osmotische fragiliteitstest; in het bijzonder, in deze serie, had de AGLT een gevoeligheid van 95%, vergelijkbaar met die gevonden door anderen1,15,43,44 en hoger dan die gerapporteerd door Cynober et al.10 en Bucx et al.45 De gevoeligheid van de AGLT was ook hoog in gecompenseerde gevallen en in die met een niet-gedetecteerd biochemisch defect. Bovendien is het vermeldenswaard dat de AGLT de tien EMA-negatieve gevallen van hereditaire sferocytose identificeerde.

Door de associatie van EMA-binding en de AGLT konden alle gevallen van hereditaire sferocytose in deze serie worden geïdentificeerd; aangezien niet in alle diagnoselaboratoria een flowcytometer beschikbaar is, is het vermeldenswaard dat de AGLT plus de osmotische kwetsbaarheidstest met NaCl op geïncubeerd bloed de diagnostische gevoeligheid verhoogt tot 97%, vergelijkbaar met die welke eerder werd gerapporteerd in een grotere serie patiënten4: in elk geval is deze waarde hoger dan die welke wordt verkregen door een combinatie van EMA-binding en de cryohemolyse-test, zoals onlangs gerapporteerd door Crisp et al.12

Figuur 3. (A) Gemiddelde kanaalfluorescentiewaarden bij normale controles en patiënten met hereditaire sferocytose (HS) op verschillende dagen van opslag. (B-C) Resultaten van de EMA-bindingstest in monsters van 150 HS-patiënten, gegroepeerd volgens verzending (B) en dagen van opslag vóór de test (C). ■ Controles, – HS niet verzonden, ○ HS verzonden.

Figuur 4.Stroomdiagram voor laboratoriumdiagnose van hereditaire sferocytose (HS).

De ziektespecificiteit van de diagnostische tests voor erfelijke sferocytose werd geëvalueerd door een grote groep patiënten met verschillende typen hemolytische anemie op te nemen die morfologische en laboratoriumkenmerken kunnen vertonen die lijken op die van erfelijke sferocytose. Zoals verwacht waren de resultaten van de EMA-binding, in termen van procentuele fluorescentievermindering, alleen direct gerelateerd aan het aantal sferocyten bij patiënten met erfelijke sferocytose, maar niet bij patiënten met auto-immuun hemolytische anemie, zelfs niet bij degenen met duidelijke sferocytose: deze waarneming komt overeen met de hoge ziektespecificiteit van deze test die door anderen is gerapporteerd.19-21,25 Wij vonden dat de andere tests, met name die op basis van glycerol, minder specifiek zijn dan EMA-binding, aangezien zij, zoals eerder gerapporteerd,8,9,14,15,46 ook vaak positief zijn bij verworven hemolytische anemieën. Vermeldenswaard is dat geen van de beschikbare diagnostische tests voor erfelijke sferocytose, direct noch indirect, een onderscheid maakt tussen erfelijke sferocytose en congenitale dyserythropoiëtische anemie type II. Deze laatste aandoening, hoewel minder voorkomend dan hereditaire sferocytose, kan de klinische presentatie, de rode celmorfologie en de verhoogde osmotische breekbaarheid van de rode cel van hereditaire sferocytose nabootsen en kan een SDS-PAGE analyse vereisen om geïdentificeerd te worden: Mariani et al. meldden dat 13% van de gevallen die naar een referentielaboratorium waren verwezen met het voorlopige label van hereditaire sferocytose, congenitale dyserythropoiëtische anemie type II bleken te zijn bij onderzoek met SDS-PAGE.47

De diagnostische richtlijnen voor hereditaire sferocytose van het British Committee for Standards in Hematology,19 de enige tot nu toe beschikbare, bevelen ofwel EMA-binding ofwel de cryohemolyse-test aan als screeningsmethode,16 waarbij de beschikbaarheid van een flowcytometer de doorslag geeft bij de keuze. In de richtsnoeren wordt niet gespecificeerd of in geval van equivocale of borderline resultaten beide tests moeten worden uitgevoerd. Hoe dan ook, zelfs de combinatie van deze twee tests geeft een sensitiviteit van 93%, vergelijkbaar met die van EMA-binding of AGLT alleen gebruikt, en veel lager dan die verkregen door de combinatie van EMA-binding plus AGLT.

Zoals te zien is in figuur 4, kan bij een patiënt met DAT-negatieve chronische hemolyse met sferocyten, de negativiteit van zowel EMA als AGLT erfelijke sferocytose worden uitgesloten. Positiviteit van EMA-binding (met een positieve of negatieve AGLT) leidt tot de diagnose van erfelijke sferocytose, behalve in die niet-dominante gevallen met onvoldoende reticulocytose11 waarvoor SDS-PAGE-analyse nodig is om congenitale dyserythropoëtische anemie type II uit te sluiten. SDS-PAGE-analyse kan ook nodig zijn in de zeldzame EMA-negatieve, AGLT-poistieve gevallen met een negatieve familieanamnese, vanwege de geringere ziektespecificiteit van AGLT.

Concluderend kan worden gesteld dat geen enkele test in staat is alle gevallen van erfelijke sferocytose te identificeren. De combinatie van EMA-binding, die zich rechtstreeks richt op het structurele defect van erfelijke sferocytose, en AGLT, dat gebruik maakt van de verhouding tussen oppervlakte en volume van de rode cel, stelde ons in staat alle patiënten met erfelijke sferocytose in deze serie te identificeren en vormt daarom een zeer effectieve diagnostische strategie voor erfelijke sferocytose, ook in milde/gecompenseerde gevallen. Benadrukt moet echter worden dat de diagnose van hereditaire sferocytose de laatste stap is van een diagnostische work-up die niet alleen gebaseerd is op laboratoriumonderzoek, maar ook op klinisch onderzoek, persoonlijke familieanamnese en de uitsluiting van mogelijke oorzaken van secundaire sferocytose.

Footnotes

• Financiering: dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Stichting IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico van Milaan, RC2009 160/01 en ENERCA III project, EC 2008, conventie n. 210.
• Auteurschap en DisclosuresDe informatie die door de auteurs is verstrekt over bijdragen van personen die als auteur en in acknowledgments zijn vermeld, is beschikbaar met de volledige tekst van dit artikel op www.haematologica.org.
• Financiële en andere openbaarmakingen door de auteurs met behulp van de ICMJE (www.icmje.org) Uniform Format for Disclosure of Competing Interests zijn ook beschikbaar op www.haematologica.org.

• Ontvangen op 4 augustus 2011.
• Revisie ontvangen 11 oktober 2011.
• Accepted October 26, 2011.

1. Eber SW, Pekrun A, Neufeldt A, Schröter W. Prevalence of increased osmotic fragility of erythrocytes in German blood donors: screening using a modified glycerol lysis test. Ann Hematol. 1992; 64(2):88-92. PubMedhttps://doi.org/10.1007/BF01715351Google Scholar
2. Tse WT, Lux SE. Red blood cell membrane disorders. Br J Haematol. 1999; 104(1):2-13. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1999.01130.xGoogle Scholar
3. Gallagher PG. Red cell membrane disorders. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2005;13-8. Google Scholar
4. Mariani M, Barcellini W, Vercellati C, Marcello AP, Fermo E, Pedotti P. Clinical and hematologic features of 300 patients affected by hereditary spherocytosis grouped according to the type of the membrane protein defect. Haematologica. 2008; 93(9):1310-7. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.12546Google Scholar
5. Hematology of infancy and childhood. Saunders: Philadelphia; 2009. Google Scholar
6. Parpart AK, Lorenz PB, Parpart ER, Gregg JR, Chase AM. The osmotic resistance (fragility) of human red cells. J Clin Invest. 1947; 26(4):636-40. PubMedhttps://doi.org/10.1172/JCI101847Google Scholar
7. Gottfried EL, Robertson NA. Glycerol lysis time of incubated erythrocytes in the diagnosis of hereditary spherocytosis. J Lab Clin Med. 1974; 84(5):746-51. PubMedGoogle Scholar
8. Zanella A, Izzo C, Rebulla P, Zanuso F, Perroni L, Sirchia G. Acidified glycerol lysis test: a screening test for spherocytosis. Br J Haematol. 1980; 45(3):481-6. PubMedGoogle Scholar
9. Vettore L, Zanella A, Molaro GL, De Matteis MC, Pavesi M, Mariani M. Een nieuwe test voor de laboratoriumdiagnose van sferocytose. Acta Haematol. 1984; 72(4):258-63. PubMedGoogle Scholar
10. Cynober T, Mohandas N, Tchernia G. Red cell abnormalities in hereditary spherocytosis: relevance to diagnosis and understanding of the variable expression of clinical severity. J Lab Clin Med. 1996; 128(3):259-69. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-2143(96)90027-XGoogle Scholar
11. Perrotta S, Gallagher PG, Mohandas N. Hereditary spherocytosis. Lancet. 2008; 372(9647):1411-26. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0140-6736(08)61588-3Google Scholar
12. Crisp RL, Solari L, Vota D, García E, Miguez G, Chamorro ME. A prospective study to assess the predictive value for hereditary spherocytosis using five laboratory tests (cryohemolysis test, eosin-5′-maleimide flow cytometry, osmotic fragility test, autohemolysis test, and SDS-PAGE) on 50 hereditary spherocytosis families in Argentina. Ann Hematol. 2011; 90(6):625-34. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s00277-010-1112-0Google Scholar
13. Korones D, Pearson HA. Normal erythrocyte osmotic fragility in hereditary spherocytosis. J Pediatr. 1989; 114(2):264-6. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-3476(89)80794-2Google Scholar
14. Apel D, Maria ska B, Maj S. Diagnostic value of acidified glycerol lysis test (AGLT) in hereditary spherocytosis and selected hematologic diseases. Acta Haematol Pol. 1993; 24(3):267-71. PubMedGoogle Scholar
15. Brabec V, Marík T, Feixová H, Slavíková V. New tests for laboratory diagnosis of spherocytosis. Vnitr Lek. 1991; 37(11-12):883-7. PubMedGoogle Scholar
16. Iglauer A, Reinhardt D, Schröter W, Pekrun A. Cryohemolysetest als diagnostisch hulpmiddel voor erfelijke sferocytose. Ann Hematol. 1999; 78(12):555-7. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s002770050557Google Scholar
17. Streichman S, Gescheidt Y. Cryohemolysis for the detection of hereditary spherocytosis: correlation studies with osmotic fragility and autohemolysis. Am J Hematol. 1998; 58(3):206-12. PubMedhttps://doi.org/10.1002/(SICI)1096-8652(199807)58:3<206::AID-AJH8>3.0.CO;2-VGoogle Scholar
18. King MJ, Behrens J, Rogers C, Flynn C, Greenwood D, Chambers K. Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane cytoskelet-associated haemolytic anaemia. Br J Haematol. 2000; 111(3):924-33. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02416.xGoogle Scholar
19. Bolton-Maggs PH, Stevens RF, Dodd NJ, Lamont G, Tittensor P, King MJ, Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis. Br J Haematol. 2004; 126(4):455-74. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2004.05052.xGoogle Scholar
20. King MJ, Telfer P, MacKinnon H, Langabeer L, McMahon C, Darbyshire P, Dhermy D. Using the eosin-5-maleimide binding test in the differential diagnosis of hereditary spherocytosis and hereditary pyropoikilocytosis. Cytometry B Clin Cytom. 2008; 74(4):244-50. PubMedGoogle Scholar
21. King MJ, Bruce L, Whiteway A. The mutant erythrocyte band 3 protein in Southeast Asian ovalocytosis does not bind eosin-5-maleimide. Int J Lab Hematol. 2009; 31(1):116-7. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2007.01019.xGoogle Scholar
22. King MJ, Jepson MA, Guest A, Mushens R. Detection of hereditary pyropoikilocytosis by the eosin-5-maleimide (EMA)-binding test is attributable to a marked reduction in EMA-reactive transmembrane proteins. Int J Lab Hematol. 2011; 33:205-211. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2010.01270.xGoogle Scholar
23. Kedar PS, Colah RB, Kulkarni S, Ghosh K, Mohanty D. Experience with eosin-5′-maleimide as a diagnostic tool for red cell membrane cytoskeleton disorders. Clin Lab Haematol. 2003; 25(6):373-6. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.0141-9854.2003.00557.xGoogle Scholar
24. Stoya G, Gruhn B, Vogelsang H, Baumann E, Linss W. Flow cytometry as a diagnostic tool for hereditary spherocytosis. Acta Haematol. 2006; 116(3):186-91. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000094679Google Scholar
25. Girodon F, Garçon L, Bergoin E, Largier M, Delaunay J, Fénéant-Thibault M. Usefulness of the eosin-5′-maleimide cytometric method as a first-line screening test for the diagnosis of hereditary spherocytosis: comparison with ektacytometry and protein electrophoresis. Br J Haematol. 2008; 140(4):468-70. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2007.06944.xGoogle Scholar
26. Kar R, Mishra P, Pati HP. Evaluation of eosin-5-maleimide flow cytometric test in diagnosis of hereditary spherocytosis. Int J Lab Hematol. 2010; 32(1 Pt 2):8-16. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2008.01098.xGoogle Scholar
27. Riley CH, Nikolajsen K, Kjaersgaard E, Klausen TW, Mourits-Andersen T, Clausen N, Lausen B, Rosthøj S, Birgens H. Flowcytometrische diagnostiek van hereditaire sferocytose. Ugeskr Laeger. 2009; 171(49):3610-4. PubMedGoogle Scholar
28. D’Alcamo E, Agrigento V, Sclafani S, Vitrano A, Cuccia L, Maggio A. Betrouwbaarheid van EMA bindingstest in de diagnose van hereditaire sferocytose bij Italiaanse patiënten. Acta Haematol. 2011; 125(3):136-40. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000322253Google Scholar
29. Tachavanich K, Tanphaichitr VS, Utto W, Viprakasit V. Rapid flow cytometric test using eosin-5-maleimide for diagnosis of red blood cell membrane disorders. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2009; 40(3):570-5. PubMedGoogle Scholar
30. King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eosin-5-maleimide binding aan band 3 en Rh-gerelateerde eiwitten vormt de basis van een screening test voor hereditaire sferocytose. Br J Haematol. 2004; 124(1):106-13. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2003.04730.xGoogle Scholar
31. Barcellini W, Clerici G, Montesano R, Taioli E, Morelati F, Rebulla P, Zanella A. In vitro kwantificering van anti-rode bloedcel antilichaam productie in idiopathische auto-immuun hemolytische anemie: effect van mitogen en cytokine stimulatie. Br J Haematol. 2000; 111(2):452-60. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02380.xGoogle Scholar
32. Dacie JV, Lewis SM. Praktische hematologie. Churchill Livingston: London; 2001. Google Scholar
33. Dodge JT, Mitchell C, Hanahan Dj. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes. Arch Biochem Biophys. 1963; 100:119-30. PubMedhttps://doi.org/10.1016/0003-9861(63)90042-0Google Scholar
34. Fairbanks G, Steck TL, Wallach DF. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemie. 1971; 10(13):2606-17. PubMedhttps://doi.org/10.1021/bi00789a030Google Scholar
35. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680-5. PubMedhttps://doi.org/10.1038/227680a0Google Scholar
36. Beutler E. Red cell metabolism: a manual of biochemical methods. Grune &amp; Stratton Inc: New York, NY; 1984. Google Scholar
37. Iolascon A, Avvisati RA. Genotype/fenotype correlatie in hereditaire sferocytose. Haematologica. 2008; 93(9):1283-8. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.13344Google Scholar
38. Romero RR, Poo JL, Robles JA, Uriostegui A, Vargas F, Majluf-Cruz A. Usefulness of cryohemolysis test in the diagnosis of hereditary spherocytosis. Arch Med Res. 1997; 28(2):247-51. PubMedGoogle Scholar
39. Golan DE, Corbett JD, Korsgren C, Thatte HS, Hayette S, Yawata Y, Cohen CM. Control of band 3 lateral and rotational mobility by band 4.2 in intact erythrocytes: release of band 3 oligomers from low-affinity binding sites. Biophys J. 1996; 70(3):1534-42. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0006-3495(96)79717-5Google Scholar
40. Godal HC, Gjønnes G, Ruyter R. Does preincubation of the red blood cells contribute to the capability of the osmotic fragility test to detect very mild forms of hereditary spherocytosis? Scand J Haematol. 1982; 29(1):89-93. PubMedGoogle Scholar
41. Practical haematology. Churchill Livingstone; 1991. Google Scholar
42. Iolascon A, Miraglia del Giudice E, Perrotta S, Alloisio N, Morlé L, Delaunay J. Hereditary spherocytosis: from clinical to molecular defects. Haematologica. 1998; 83(3):240-57. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000015191Google Scholar
43. Mittler U, Radig K, Kluba U, Aumann V, Röppnack R. Experience with the glycerol lysis test in acid medium in diagnosis of hereditary spherocytosis. Kinderarztl Prax. 1993; 61(6):219-22. PubMedGoogle Scholar
44. Hoffmann JJ, Swaak-Lammers N, Breed WP, Strengers JL. Diagnostic utility of the pre-incubated acidified glycerol lysis test in haemolytic and non-haemolytic anaemias. Eur J Haematol. 1991; 47(5):367-70. PubMedGoogle Scholar
45. Bucx MJ, Breed WP, Hoffmann JJ. Comparison of acidified glycerol lysis test, Pink test and osmotic fragility test in hereditary spherocytosis: effect of incubation. Eur J Haematol. 1988; 40(3):227-31. PubMedGoogle Scholar
46. Rutherford CJ, Postlewaight BF, Hallowes M. An evaluation of the acidified glycerol lysis test. Br J Haematol. 1986; 63(1):119-21. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1986.tb07501.xGoogle Scholar
47. Mariani M, Vercellati C, Bianchi P, Marzorati S, Caneva L, Soligo C. Congenital dyserythropoietic anemia type II (CDA II) mimicking hereditary spherocytosis (HS): report of 12 cases detected by SDSPAGE. Hematol J. 2002; 3:353. Google Scholar