Een RNA-producerende DNA hydrogel als een platform voor een hoge prestaties RNA-interferentie systeem

Synthese en karakterisering van de I-gel

De vier oligonucleotiden van X-DNA (X01-X04 DNA strengen) werden commercieel gesynthetiseerd door Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA). De X-DNA sequenties (Supplementary Tabel 5) werden ontworpen, bereid, en gekarakteriseerd door het volgen van dezelfde procedures zoals beschreven in de literatuur met kleine wijzigingen 10,13. Gelyofiliseerde DNA strengen in 1 pmol schaal werd verzameld door centrifugatie bij 14.000 g gedurende 15 s bij kamertemperatuur. Elke DNA-streng werd geresuspendeerd tot 1,0 mM concentratie in 1x TE-buffer (pH 8,0). Elke buis werd geschud en gemengd met behulp van MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) bij 1500 rpm gedurende ~ 3 uur om volledig op te lossen de gevriesdroogde oligonucleotiden. In totaal werd 0,05 umol (50 pi) van elke DNA-streng gecombineerd tot een 1,5 ml buis, en nuclease-vrij water werd toegevoegd met het totale volume van oligonucleotide mengsel tot 500 pi. 100 μl van het oligonucleotidenmengsel werd verdeeld over buisjes van 0,5 ml. De buisjes werden in een thermocycler (Bio-Rad, CA, USA) geplaatst. De vier soorten oligonucleotiden (X01 ~ 04) werden geanneed onder de volgende omstandigheden: aanvankelijke denaturatie bij 95 ° C gedurende 10 min, en 65 ° C gedurende 2 min, 60 ° C gedurende 5,5 min, daling met 1 ° C handhaven van 1 min bij die temperatuur, 20 ° C gedurende 30 s, en daling tot 4 ° C voor stabilisatie en opslag van X-DNA. Dan, voor buffer uitwisseling, de uitgegloeide X-DNA oplossing (500 pi) in een filtereenheid (3-kDa Mw cutoff) voor microcentrifugatie werd gecentrifugeerd gedurende 6 uur bij 15.000 g en 4 ° C om het oplosmiddel volume te verminderen. De filtereenheid werd overgebracht in een nieuw centrifugeerbuisje. In totaal werd 100 μl nucleasevrij water van 4 °C aan de filtereenheid toegevoegd. De filtereenheid werd gecentrifugeerd gedurende 4 uur bij 15.000 g en 4 ° C om X-DNA spoelen van de resterende zouten. De afgesneden filtermodule wordt omgekeerd in het buisje geplaatst en bij 2000 g gedurende 3 min. bij 4 °C gecentrifugeerd. De toevoeging van nuclease-vrij water en centrifugatie werden uitgevoerd nog twee keer met dezelfde centrifugebuis volledig te verwijderen resterende zout van X-DNA. Het uiteindelijke volume van X-DNA oplossing zal ~ 300 pi. De siRNA expressie plasmide (I-plasmide) werd gekocht en maxi-bereid door Cosmo Genetech (Seoul, Zuid-Korea). Om de I-gels te construeren, werden de I-plasmiden gelineariseerd met behulp van het restrictie-enzym BamHI. De grootte van het siRNA-gen was 66 bp met de spacer (of 498 bp met de T7-promotor) (zie supplementaire figuur 4 voor de I-plasmidekaart). De DNA-hoeveelheden van de monsters werden bepaald uit hun UV/Vis-absorptiewaarde met behulp van een BioSpectrometer (Eppendorf, Hamburg, Duitsland). Het X-DNA en de lineaire plasmiden werden eerst gemengd bij een vooraf bepaalde molaire verhouding in aanwezigheid van T4 DNA-ligase (Promega, Madison, WI, USA) om de Dgel te synthetiseren. Voor een X-DNA:I-plasmide verhouding van 1500:1, gebruikten we 10,5 pi van 75 pM X-DNA en 5,25 pi van 100 nM plasmide in een 30 pi reactievolume. Voor de Blank-gel experiment, werd dezelfde hoeveelheid X-DNA materiaal als in de I-gel geligeerd met T4 DNA-ligase. 10 µL van elk monster werd gemengd met 2 µL gel loading buffer en geëlektroforeerd op een 0,7 of 2% agarose gel bij 100 V gedurende 60 min. Alle DNA’s (X-DNA, I-plasmide, Blank-gel, en I-gel) werden bevestigd door agarose gelelektroforese (Aanvullende Figuren 3, 11, 18). De gesynthetiseerde Dgels werden tweemaal ontzout met Amicon 3-kDa Mw cutoff microtubulaire centrifugale filters. Voor scanning elektronen microscopie (SEM) beeldvorming, werden de monsters gevriesdroogd in een FreeZone vriesdroger (Labconco, Kansas City, MO, USA) totdat al het water was verwijderd. De gedroogde monsters werden gekraakt om hun verse oppervlakten te onthullen. Na te zijn sputter-gecoat met een 2 ~ 3-nm Pt laag voor 100 s, werden de morfologieën van deze hydrogel oppervlakken waargenomen bij ~ 50.000 × vergroting met behulp van een S-3500N (Hitachi, Tokyo, Japan) scanning elektronenmicroscoop bij een versnellende spanning van 15 kV (Supplementary Figuur 19).

I-gel stabiliteit test

Zeven monsters werden bereid voor elk van de vrije I-plasmide en I-gel. In elk monster werd 2 µL van de vrije I-plasmide (57 ng) of I-gel (1:1500 gel met 57 ng I-plasmide) verdund in 12 µL gedestilleerd water, vervolgens werd 4 µL transcriptie-geoptimaliseerde 5 × buffer toegevoegd en behandeld met 3,33 × 10-5 eenheden DNase I (nr. M6101; Promega) tot 20 µL eindvolume, gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende respectievelijk 0, 1, 4, 12, 24 en 48 uur. Na incubatie werden de 20 µL monsters gescheiden in twee aliquots van 10 µL, één voor elektroforese en één voor vervolgtranscriptie. In elk van de aliquots werd de denaturatiereactie beëindigd door toevoeging van 1 µL RQ1 DNase stop-oplossing en incubatie gedurende 10 min. bij 65 °C. Daarna werd 10 µL van elk monster gemengd met 2 µL gel loading buffer en geëlektroforeerd op een 2% agarose gel bij 100 V gedurende 60 min (supplementaire figuur 13). Een ander aliquot van elk monster werd gebruikt voor transcriptie reactie op de transcriptie efficiëntie van I-gel na de spijsvertering reactie aan te tonen. shRNAs werden getranscribeerd van de I-gel of vrije I-plasmide sjablonen (0, 24, 48 h) met behulp van transcriptie kit (Riboprobe; Promega) volgens de instructies van de fabrikant. De verkregen shRNA’s werden gekwantificeerd door RT-qPCR zoals beschreven in Totaal RNA voorbereiding en omgekeerde transcriptie en Real-time PCR en data-analyse secties (Supplementary Table 4).

Expressie en remming analyses van eiwitten

Gekoppelde transcriptie en vertaling kits (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, catalogusnr. 88882) werden gekocht bij Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), en de reacties werden uitgevoerd door het volgen van de procedures voorgesteld door de fabrikant. In het kort werden het HeLa-cellysaat, de accessoire eiwitten, het reactiemengsel en de pcDNA3.1( + ) IRES GFP plasmide (0,5 μg/μL; nr. 51406; Addgene, Cambridge, MA, USA) gemengd in een 12,5:2.5:5:2 (v / v) verhouding en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 1, 2, 4, en 6 uur. Na de aangegeven reactietijden, werden de monsteroplossingen geïncubeerd gedurende 24 uur bij 4 ° C om zowel te stoppen met de reactie en zorgen voor voldoende eiwit vouwing tijd. Om de interferentie efficiëntie te evalueren, werd vrije I-plasmide of I-gel toegevoegd aan de cel lysaat in aanwezigheid van 1000 ng van GFP plasmide. In de controle-experimenten voor de geoptimaliseerde I-gel voorwaarde die 57 ng van I-plasmide (17,5 nmol), gescrambelde shRNA (17,5 nmol en 1,75 umol; 1 eq en 100 eq om de hoeveelheid I-plasmide, respectievelijk) (SN-1003; Bioneer, Seoul, Korea), gescrambelde plasmide mengsel (17.5 nmol; dooreen gehaspeld shRNA-expressieplasmidemengsel; Cosmo Genetech), dooreen gehaspelde plasmidegel (dooreen gehaspeld plasmidemengsel dat enzymatisch is gekoppeld met X-DNA), de I-gelcomponent (alleen X-DNA, alleen I-plasmide, of deze mengsels zonder enzymatische koppeling; dat wil zeggen, geen gelvorming), of Blank-gel (enzymatische koppeling van alleen X-DNA’s) werden rechtstreeks aan de GFP-expressiereactieoplossing toegevoegd. Alle reacties werden ten minste driemaal uitgevoerd. Tenzij anders vermeld, werd het reactievolume op 25 μL gehouden. De fluorescentiespectra werden geanalyseerd met een spectrofluorofotometer (FluoroMate FS-2; SCINCO Co., Ltd., Seoul, Korea) voor het bepalen van het niveau van GFP expressie in de cellysaat oplossing.

Totaal RNA voorbereiding en reverse transcriptie

Als een spike-in controle, 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL; No. 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Canada) werd toegevoegd aan alle van de voorgeëxpresseerde cellysaten (20 µL) vóór RNA-extractie. Vervolgens werd totaal RNA geëxtraheerd uit 23 µL van het lysaat met TRIzol Reagent (Ambion, Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant. Het geëxtraheerde totale RNA werd opgelost in 10 µL met DEPC behandeld water (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Vervolgens werd 2 µL totaal RNA gepolyadenyleerd met 1 mM ATP in 1 × poly(A) polymerase buffer met 5 U Escherichia coli poly(A) polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) bij 37 °C gedurende 30 min in een reactiemengsel van 20 µL. Voor de omgekeerde transcriptie werd 4 µL van het gestaart RNA gemengd met 1 pmol RT-primer en 0,5 mM dNTP-mix en vervolgens met DEPC-behandeld water aangevuld tot een volume van 13 µL. Het mengsel werd gedurende 5 minuten bij 65 °C verhit en vervolgens snel op ijs afgekoeld. Het reactiemengsel werd vervolgens aangevuld tot een eindvolume van 20 µL door toevoeging van 5 mM dithiothreitol, 1 × eerstestrengsbuffer, 40 U RNaseremmer en 200 U SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en gedurende 1 uur geïncubeerd bij 50 °C, gevolgd door enzyminactivatie bij 70 °C gedurende 15 min. De RT primer sequenties (zie aanvullende tabel 5) werden ontworpen voor de synthese van cDNA uit het RNA sequentie. De gebruikte primer was de 3′ RACE adapter, die wordt geleverd in de FirstChoice RLM-RACE kit (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Alle primers werden gesynthetiseerd door Cosmo Genetech, met uitzondering van de cel-miR-39 forward primer (Norgen Biotek Corp.). De recovery rate van RNA in elk lysaat oplossing werd geschat op basis van het verschil tussen de CT-waarde van de verkregen spike-in controle en die van de referentie cel-miR-39 (niet doorgegaan met het extractieproces).

Real-time PCR en data-analyse

De hoeveelheden shRNA en GFP mRNA werden gekwantificeerd door qPCR met behulp van de StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De qPCR van elk monster werd uitgevoerd in een totaal volume van 20 µL met 2 µL cDNA, 10 µL van 2 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific), en 10 pmol van elke primer. De amplificatie werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: aanvankelijke denaturatie bij 95 °C gedurende 10 min; en 30 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 30 s, en 72 °C gedurende 30 s. De qPCR werd ook uitgevoerd met cel-miR-39 als referentie-RNA om de recovery rate van totaal RNA in elk monster te verkrijgen. Het qPCR-protocol was hetzelfde als hierboven in dit deel beschreven, behalve voor de gebruikte primers, die 10 pmol van een gemeenschappelijke reverse primer (hetzelfde als de shRNA reverse primer) en cel-miR-39 forward primer waren. De smeltcurve van elk geamplificeerd DNA-product werd verkregen door het meten van de fluorescentie-intensiteitsverandering van de SYBR Green kleurstof gedurende zes maal per monster terwijl de temperatuur van 60 °C tot 95 °C werd verhoogd met een snelheid van + 0,3 °C/s na voltooiing van de qPCR. De specifieke primers voor qPCR werden ontworpen met behulp van het Primer3-programma (http://primer3.ut.ee/) (supplementaire tabel 5). De relatieve expressie van de targets werd bepaald met behulp van de vergelijkende 2-ΔΔCT methode. De relatieve hoeveelheid GFP-mRNA werd ook bevestigd door bandintensiteitmeting op de 2% agarosegel. Amplificatie van het cDNA werd uitgevoerd met dezelfde PCR-condities en hetzelfde programma als gebruikt voor de hierboven beschreven qPCR, met uitzondering van het PCR-cylusnummer (20 voor GFP-mRNA).

Kalibratie en kwantificering van de absolute hoeveelheid RNA

Standaardcurven voor de RNA-concentratie en CT-waarde werden verkregen door gebruik te maken van elk RNA-standaardmateriaal. Voor het shRNA werd de standaardcurve verkregen door gebruik te maken van gesynthetiseerde shRNA’s, gekocht bij Integrated DNA Technologies. Voor de GFP mRNA, werd de curve verkregen met behulp van de GFP mRNA geëxtraheerd uit een transcriptie kit (Riboprobe; Promega) volgens de instructies van de fabrikant. De hoeveelheid RNA van de standaard shRNA werd meegedeeld door Integrated DNA Technologies, terwijl die van het geëxtraheerde standaard GFP mRNA werd bepaald uit de UV/Vis-absorptiewaarde met behulp van de BioSpectrometer. De verkregen standaard RNA’s werden omgezet in cDNA door omgekeerde transcriptie, zoals hierboven beschreven in de “Totaal RNA voorbereiding en omgekeerde transcriptie” sectie. Daarna werd het cDNA 10, 100, 1000 en 10.000 maal verdund, waarna qPCR driemaal werd herhaald en de verkregen CT-waarden werden gebruikt om een standaardcurve te verkrijgen. De CT-waarden verkregen uit de RT-qPCR werden omgezet in de oorspronkelijke RNA concentraties in de cellysaten door middel van een kalibratie proces (Supplementary Figuur 6). De uiteindelijke absolute hoeveelheid RNA werd bepaald door vermenigvuldiging van elke RNA recovery rate (%) en de waarde van RNA bedrag van de kalibratiecurve (Supplementary tabellen 1, 2).

Cellulaire labeling met Cy5-I-gel

Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellen werden verkregen van de Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea) en onderhouden in DMEM aangevuld 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine in een bevochtigde en CO2 (5%) -behouden incubator. De MDCK tot expressie brengen GFP (MDCK-GFP) cellen werden bereid door transfecteren pEGFP-N1 vector in de cellen met het gebruik van Lipofectamine reagentia (Thermo Fisher Scientific) volgens het protocol van de fabrikant. Daarna sorteerden we de GFP-emitterende cellen met behulp van het FACSCanto II-systeem (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Gedurende het hele onderzoek werden de cellen negatief getest op mycoplasma besmetting. Gekweekte MDCK-GFP-cellen in 24-wellsplaten met dekglaasjes (50.000 cellen per putje) werden gedurende 4 uur in serumvrij medium gecubeerd met de Cy5-I-gel (Cy5-geconjugeerde I-gel) die Cy5-geconjugeerde X01 DNA-sequentiestrengen (overeenkomend met 2,625 μM X-DNA; Integrated DNA Technologies) bevat. Voor de bereiding van de Cy5-I-plasmide, werd Cy5-dsDNA (Cy5-geconjugeerd dsDNA) eerst bereid door annealing Cy5-geconjugeerd X01 (met een extra 5′-p-GATC kleverig einde) en de complementaire tegenstreng (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′). Vervolgens werden het Cy5-dsDNA en de I-plasmide gemengd en geligeerd bij een molverhouding van 5000:1. Overtollig ongebonden Cy5-dsDNA werd verwijderd door centrifugeren (12.400 g, 4 °C, 60 min) met Amicon microtubulaire centrifugaalfilters (50 kDa Mw cutoff) gedurende 4-5 keer. De Cy5-shRNA (Cy5-geconjugeerd shRNA) werd commercieel gesynthetiseerd (Integrated DNA Technologies). Voor de Cy5-I-plasmide en Cy5-shRNA sets, werden cellen samengevallen met 2,625 nM van elk monster in serumvrij medium gedurende 4 uur. Voor de Lipofectamine-Cy5-I-plasmide en Lipofectamine-Cy5-shRNA sets, Lipofectamine en de Cy5-geconjugeerd monster werden elektrostatisch gecomplexeerd door ze te mengen samen in een molverhouding van 1:1 tot een uiteindelijke oplossing concentratie van 2,625 pM Lipofectamine en 2,625 pM substraat. Vervolgens werden cellen samen met de 2,625 uM Lipofectamine-Cy5-I-plasmide of Lipofectamine-Cy5-shRNA in serumvrij medium gedurende 4 uur, respectievelijk. In het geval van de cel-only controle, werden de cellen samen met serumvrij DMEM met 1% (v / v) penicilline (HyClone). Na 4 uur coincubatie werden alle monsters tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer (0,1 M, pH 7,4) en werden de cellen verder gedurende 6 uur geïncubeerd in een groeimedium dat 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS; HyClone) en 1% penicilline bevatte om voldoende cellulair herstel en opnametijd te garanderen. De gekweekte cellen werden gefixeerd met 4% formaldehyde gedurende 10 min bij kamertemperatuur en verder driemaal gewassen met PBS-buffer (0,1 M, pH 7,4). Voor de microscoop beeldvorming, werden dekglaasjes met de aangehechte cellen gemonteerd op glasplaatjes met behulp van waterige montage medium met een antifading agent. De fluorescentie beelden werden opgenomen met behulp van een Zeiss Axioplan 2 microscoop, en foto’s werden genomen met behulp van een Zeiss Axiocam HR camera.

GFP-gen-silencing experiment met behulp van de I-gel

Eerst werd de I-gel met 262,5 µM X-DNA en 175 nM I-plasmide geïncubeerd met 300 U van T7 RNA polymerase (Thermo Fisher Scientific) gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Na de incubatie werd het I-gelmonster tot 100 maal verdund in serumvrij DMEM dat 1% penicilline bevat. Vervolgens werd 1/6 maal het volume van I-gel / polymerase complex toegevoegd aan elk putje van een 24-well plaat met dekglaasje die was voorgeplant met MDCK-GFP cellen (20.000 cellen per putje) gedurende 24 uur. Voor de I-plasmide, scrambled plasmide mengsel, en scrambled plasmide gel sets, werden MDCK-GFP cellen gecultiveerd met dezelfde molaire hoeveelheid van elk plasmide en T7 RNA polymerase als in het geval van de I-gel. Voor het meten van de RNAi-effect van naakt shRNA en Lipofectamine-shRNA, 100-voudig meer van elk RNA monster werd gebruikt ten opzichte van het aantal I-plasmide sjabloon, rekening houdend met de shRNA expressiesnelheid van de I-gel zoals berekend uit de cel lysaat experiment. Voor de naakte shRNA en gescrambelde shRNA sets, werden MDCK-GFP cellen samen met 175 nM van het RNA monster. De Lipofectamine-gecomplexeerde monsters werden bereid volgens de instructies van de fabrikant. Voor de Lipofectamine-I-plasmide en Lipofectamine-scrambled plasmide mengsel sets, Lipofectamine en elk plasmide monster werden elektrostatisch gecomplexeerd door ze te mengen in een molverhouding van 5:1 tot een uiteindelijke oplossing concentratie van 8,75 nM Lipofectamine en 1,75 nM plasmide substraat te verkrijgen. Voor de Lipofectamine-shRNA set, Lipofectamine en vrije shRNA werden elektrostatisch gecomplexeerd door ze te mengen in een molverhouding van 5:1 tot een uiteindelijke oplossingsconcentratie van 875 nM Lipofectamine en 175 nM shRNA te verkrijgen. De MDCK-GFP cellen werden samen geïncubeerd met de zoals bereide Lipofectamine-gecomplexeerde monsters in serumvrij medium gedurende 4 uur. Voor de cell-only set, werden alleen MDCK-GFP cellen geïncubeerd in het serumvrij medium gedurende 4 uur, zonder enige monsters. Alle monsters werden uitgewassen na de 4 uur coincubatieperiode, en de cellen werden bovendien geïncubeerd gedurende 48 uur met het groeimedium (DMEM met 10% (v / s) FBS en 1% penicilline) om het RNA-silencing effect te evalueren bij 37 ° C onder 5% CO2. De cellen werden vervolgens gefixeerd met 4% formaldehyde gedurende 10 min bij kamertemperatuur en gewassen met PBS-buffer (0,1 M, pH 7,4). Voor microscoop beeldvorming, werden de dekglaasje-bevestigde cellen gemonteerd op glasplaatjes met behulp van waterige montage medium met een antifading agent.

Genexpressie analyse door kwantitatieve PCR in levende cellen

Alle monsters werden behandeld en geïncubeerd in elke cel medium in dezelfde hoeveelheid en dezelfde voorwaarde als gebruikt in de eerder beschreven GFP-gen-silencing experiment met behulp van de I-gel sectie. Na incubatie werd het celmedium opgezogen uit de celkweekplaten, en de MDCK-GFP-cellen werden eenmaal gewassen met PBS-buffer en getrypsiniseerd om de cellen los te maken in elk putje van de plaat. De losgemaakte cellen werden verdund met PBS-buffer om de trypsine te deactiveren, en werden vervolgens verzameld in een 1,5 ml microbuisje en gepelletiseerd door centrifugatie (180 g, 5 min). Het supernatant werd verwijderd en de cellen werden verdund met 20 µL PBS-buffer. De celsuspensieoplossing (20 µL) werd behandeld met 1 mL TRIzol Reagent, 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL), en 200 µL chloroformoplossing. De daaropvolgende RNA-extractie werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Voor de kwantificering van de relatieve hoeveelheid GFP mRNA en shRNA op cellulair niveau, werden alle qPCR’s van de monster preparaten uitgevoerd in dezelfde methode zoals beschreven in de “Totaal RNA voorbereiding en reverse transcriptie” en “Real-time PCR en data-analyse” secties.

Cell imaging analyse voor pixel intensiteit kwantificering

Bij de verwerking van de cel beeld, werden de gegevens uitgevoerd met behulp van de MATLAB (The MatWorks, Inc, Beltsville, MD, USA) programma. De ruwe fluorescentiebeelden werden geïmporteerd in MATLAB, en elke pixel in de beelden werd geconverteerd naar elke component van de matrix. De verdeling van de fluorescentie-intensiteit van elke component werd grafisch voorgesteld door een histogram. De gehele dataset werd verdeeld in 256 intervallen.

Fluorescentie-geactiveerde cell sorting analyse

De cellen werden eenmaal gewassen met 1 mL PBS, gevolgd door het opzuigen van het groeimedium van de celkweekplaten. Vervolgens werden de cellen losgemaakt van de plaat door trypsine behandeling. De losgemaakte cellen werden verzameld in een 15-mL buis gevolgd door centrifugatie resulterend in een pellet (180 g, 3 min). Het supernatant trypsineoplossing werd verwijderd en de celpellet werd tweemaal gewassen met 2 mL PBS. De cellen werden geresuspendeerd in PBS tot een concentratie van 50.000 cellen/mL. Vervolgens werden de monsters bereid door fixatie van de cellen in 1% formaldehyde-oplossing gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De monsters werden geanalyseerd op GFP fluorescentie intensiteit met behulp van FACSCanto II-systeem (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Relatieve levensvatbaarheid niveaus in donkere toestand

Een MDCK-GFP celsuspensie (5000 cellen per putje) werd gedoseerd in een 96-well plaat (Corning Inc, Corning, NY, USA) en geïncubeerd gedurende 1 dag bij 37 ° C onder 5% CO2. Zodra de cellen zich aan de plaat hadden gehecht, werden zij in het donker in het groeimedium (DMEM met 10% (v/v) FBS en 1% penicilline) samen met verschillende concentraties van de I-gel (overeenkomend met de X-DNA concentratie) geïncubeerd. De I-gel was samengesteld uit een X-DNA:I-plasmide molaire verhouding van 1500:1. Deze monsters werden geïncubeerd gedurende 6, 24, en 48 uur bij 37 ° C onder 5% CO2. Aan het einde van elke incubatietijd werd volgens de instructies van de fabrikant celtellingkit-8-oplossing (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) aan de monsters toegevoegd. Na verdere incubatie gedurende 1 uur werd de extinctie bij 450 nm gemeten met een microtiterplaatlezer. De resultaten van deze meting werden uitgedrukt als de verhouding tussen de extinctie van het monster en die van de negatieve-controle cellen zonder monster incubatie.

Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met Prism 7.05 software (GraphPad Software) voor Student’s t test, een-weg ANOVA met Bonferroni meervoudige vergelijkingen post-test. De Holm-Bonferroni meervoudige vergelijkingen post test werd uitgevoerd met behulp van Bonferroni meervoudige vergelijkingen post test resultaten van Prism 7.05 software (GraphPad Software)30. De normaliteitstest werd berekend met de Shapiro-Wilk test. Uit de resultaten van de Shapiro-Wilk test bleek dat de gegevens bij benadering normaal verdeeld waren. Statistische significantie wordt aangegeven als *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.