Efficient 3-hydroxypropionic acid production from glycerol by metabolically engineered Klebsiella pneumoniae

Bij de productie van 1,3-propaandiol of 3-HP uit glycerol is melkzuur het belangrijkste bijproduct dat de productopbrengst aanzienlijk vermindert. Daarom zijn pogingen ondernomen om de lactaatproductie te verminderen door deletie van het gen dat codeert voor lactaatdehydrogenase (Kumar et al. 2013b; Zhong et al. 2014). Aangezien beide reacties die 1,3-propaandiol en 3-HP vormen, concurreren om hun gemeenschappelijke substraat 3-hydroxyaldehyde (3-HPA), bevordert deletie van propanedioloxidoreductase de 3-HP-productie (Ashok et al. 2011). Daarom werden in deze studie de genen ldhA en dhaT uitgeklopt om de 3-HP-productie te verhogen.

Effect van ldhA-deficiëntie op 3-HP-productie

De ldhA-deficiënte stam JJQ01 werd geconstrueerd en de knock-out van ldhA werd bevestigd zoals getoond in figuur S2A. De recombinante stammen Kp4(pUC18-kan-aldH) en JJQ01(pUC18-kan-aldH) werden geconstrueerd en fed-batch fermentaties werden uitgevoerd in de 5-L bioreactor. De profielen van celgroei, glycerolverbruik en metabolietenproductie worden getoond in Fig. 2a, b. Kp4(pUC18-kan-aldH) produceerde 18,3 g/L 3-HP met een opbrengst van 0,21 mol/mol in 38 h, terwijl melkzuur 32,2 g/L bereikte met een hogere opbrengst van 0,34 mol/mol. Bovendien werden 17,6 g/L 2,3-butaandiol, 6,1 g/L 1,3-propaandiol en 10,7 g/L azijnzuur geproduceerd. De vorming van lactaat verhoogt niet alleen de kosten, maar ook de moeilijkheid om 3-HP, dat een isomeer van lactaat is, terug te winnen. Bovendien is lactaat een belangrijke remmer van de biosynthese van 3-HP en 1,3-propaandiol (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). Deficiëntie van ldhA schakelde lactaatvorming effectief uit en de 3-HP productie bereikte 48,3 g/L met een opbrengst van 0,28 mol/mol, zoals getoond in Fig. 2b. De concentratie en opbrengst van 3-HP in deze ldhA-deficiënte stam waren respectievelijk 1,64-voudig en 33,3% hoger dan bij de Kp4(pUC18-kan-aldH)-stam. Behalve de kleine hoeveelheid ethanolvorming (ongeveer 4 g/L), werd de accumulatie van pyruvaat en formiaat door de ldhA-mutantstam niet waargenomen, die bijna niet werden waargenomen bij het gebruik van de wild-type stam.

Deze resultaten gaven duidelijk aan dat blokkering van de melkzuurproductie de koolstofflux sterk verlegde naar de productie van 3-HP. De assimilatie van glycerol door DhaB werd aanzienlijk verbeterd, bijna 0,4 mol/mol glycerol werd door DhaB naar 3-HPA geleid, wat consistent was met andere studies (Kumar et al. 2013b; Xu et al. 2009b). Vermindering van lactaat kon de toxiciteit voor de cellen verlagen, bevorderde de celgroei en de productiviteit van 3-HP. Vermindering van lactaat versterkte echter ook de vorming van 2,3-butaandiol en 1,3-propaandiol, die respectievelijk 21,9 g/L met een opbrengst van 0,13 mol/mol en 18,5 g/L met een opbrengst van 0,12 mol/mol bereikten. Door de ldhA-deletie zou de overmaat aan NADH, afkomstig van de verhoogde 3-HP-accumulatie, de productie van 2,3-butaandiol en 1,3-propaandiol kunnen bevorderen in plaats van lactaat om NAD+ te regenereren en de redoxbalans te bewaren. In feite ondersteunde de vorming van ethanol ook de NAD+ regeneratie, wat resulteerde in een hogere flux van pyruvaat naar ethanol dan de flux naar pyruvaat.

Effect van dhaT-deficiëntie op 3-HP productie

Deletie van ldhA stimuleerde dramatisch de 3-HP productie, tegelijkertijd werd de 1,3-propaandiol productie ook verhoogd tot 18,5 g/L. Ko et al. (2017) meldden dat 43 g/L 3-HP en 21 g/L 1,3-propaandiol werden verkregen door acetaat en andere bijproducten te reduceren. Hoewel de vorming van 1,3-propaandiol het glycerolgebruik ten goede komt door de regeneratie van cofactor, neemt het een aanzienlijk deel van de glycerolkoolstofflux voor zijn rekening. Aangezien 1,3-propaandiol en 3-HP concurreren voor dezelfde precursor 3-HPA, om de flux te beperken tot 1,3-propaandiol, werd de ldhA- en dhaT-dubbel-knockoutstam (getoond in Additional file 1: Figuur S2B) JJQ02(pUC18-kan-aldH) geconstrueerd. De resultaten van fed-batch fermentatie in de 5-L reactor worden getoond in Fig. 2c. Onverwacht resulteerde gelijktijdige uitschakeling van ldhA en dhaT slechts in 44,5 g/L 3-HP, hoewel de opbrengst werd verhoogd tot 0,32 mol/mol glycerol. De schrapping van dhaT resulteerde in een verlaagde 1,3-propaandiol titer en opbrengst tot respectievelijk 9,9 g/L en 0,07 mol/mol. Maar 1,3-propaandiol werd nog steeds geproduceerd in de reactie gekatalyseerd door YqhD en andere oxidoreductase (Ashok et al. 2013). Bovendien werd in vergelijking met JJQ01(pUC18-kan-aldH) de 2,3-butaandiolproductie licht verhoogd van 21,9 tot 23,4 g/L, wat erop wijst dat de flux naar de 2,3-butaandiolroute werd verhoogd om de overmaat aan NADH, afkomstig van de door ALDH gekatalyseerde reactie, te verbruiken. 1,3-Propaandiolsynthese speelt een sleutelrol in het reguleren van de redoxbalans in K. pneumoniae. Binnen de oxidatieroute levert de vorming van één molecuul acetaat uit glycerol drie moleculen NADH op, terwijl tegelijkertijd één molecuul ATP wordt gevormd. Bijgevolg verminderde deletie van zowel ldhA als dhaT het vermogen tot NAD+ regeneratie sterk, en werd meer NADH geoxideerd door 2,3-butaandiolvorming, wat resulteerde in meer 2,3-butaandiol. Verlaging van de beluchtingssnelheid (beperking van de zuurstoftoevoer) kon de acetaatproductie verhogen om meer ATP te leveren, maar tegelijkertijd werd er meer NADH gevormd, wat resulteerde in een verdere toename van de 2,3-butaandiolproductie. Het geregenereerde NAD+ leek echter minder te zijn dan het NAD+ dat gevormd werd in de reactie gekatalyseerd door DhaT, wat leidde tot een lagere 3-HP productie. Daarom is de levering van geschikte hoeveelheid zuurstof om NAD+ te genereren zonder de DhaB-activiteit en de glyceroldissimilatie te beïnvloeden van cruciaal belang voor de 3-HP-productie in micro-aerobe fermentatie.

In deze studie is het niet gelukt om 3-HP te verbeteren door dhaT-gen te schrappen. De glycerol dissimilatie wordt gereguleerd door glycerol dehydrogenase DhaD, glycerol kinase GlpK, glycerol dehydratase DhaB en 1,3-propanediol oxidoreductases 1,3-PDORs. De starheid van het glycerolvertakkingspunt impliceert dat verbetering van de 3-HP-productie door deletie van genen die betrokken zijn bij de glycerolfluxverdeling moeilijk is. Ashok et al. (2011) hadden de inherente activiteiten van DhaD, DhaB, ALDH en 1,3-PDORs bepaald na deletie van dhaT-gen. Zij ontdekten dat de activiteit van DhaD licht verbeterde, de activiteit van ALDH licht afnam, en de activiteit van DhaB significant afnam. Zhang et al. (2008) analyseerden ook de robuustheid op vertakkingen van de glycerol dissimilatie pathway. Er werd aangetoond dat de verdeling van de koolstofflux tussen de reductieve en de oxidatieve tak robuust was tegen de omgevingsomstandigheden.

Effect van beluchting op de 3-HP-productie

Uit onze vorige studies bleek dat micro-aerobe omstandigheden gunstig waren voor de 3-HP-productie. Vergeleken met het anaerobe proces, werd in de micro-aerobe fermentatie de 3-HP productie aanzienlijk verhoogd als gevolg van een hoger expressieniveau van aldehyde dehydrogenase, en tegelijkertijd werd de 1,3-propaandiol productie verminderd (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) meldden dat de specifieke activiteit van glyceroldehydratase in K. pneumoniae bij een beluchtingssnelheid van 0,04 vvm 59% hoger was dan die bij afwezigheid van luchttoevoer. Maar, er is gerapporteerd dat glycerol dehydratase snel geïnactiveerd kan worden door zuurstof (Toraya 2000; Ruch en Lin 1975), en de 3-HP productie aanzienlijk beïnvloedde (Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017). Bovendien wordt co-enzym B12, de cofactor voor DhaB, onvoldoende gesynthetiseerd onder hoge beluchtingsomstandigheden in de meeste van de natuurlijke 3-HPA producenten zoals K. pneumoniae. Huang et al. (2013) en Ko et al. (2017) toonden ook aan dat hoog-aerobe omstandigheden niet gunstig waren voor 3-HP productie. Daarom ondernamen we voorlopige fed-batch experimenten onder verschillende beluchtingsomstandigheden en ontdekten ook dat het handhaven van een hoge beluchtingssnelheid ongunstig was voor de 3-HP-productie nadat de celgroei was gestopt (gegevens niet weergegeven). In de fed-batch kweek van JJQ02(pUC18-kan-aldH), pasten we een beluchtingssnelheid toe die de helft bedroeg van de aanvankelijke snelheid wanneer de OD650 de maximumwaarde bereikte. De profielen van groei, glycerol en metabolieten worden getoond in Fig. 3, en de zwarte pijl gaf het tijdstip aan om de beluchtingssnelheid te verlagen (0,5 vvm).

De uiteindelijke titer van 3-HP bereikte 61.De 3-HP-concentratie en -opbrengst door JJQ02(pUC18-kan-aldH) waren 3,3- en 2,76-voudiger dan die door Kp4 (pUC18-kan-aldH), en 1,28- en 2,07-voudiger dan die door JJQ01(pUC18-kan-aldH). De resultaten toonden aan dat de productie van zowel 1,3-propaandiol als 2,3-butaandiol stopte na 20 uur. De titer van 3-HP bleef echter toenemen, hoewel de productiesnelheid vanaf dit tijdstip afnam. In het latere deel van de micro-aerobe fermentatie werd weliswaar weinig NADH geregenereerd door de vorming van 1,3-propaandiol en 2,3-butaandiol, maar toch kon nog wat NADH worden geregenereerd via de elektronentransportketen, omdat de meest efficiënte manier om NAD+ te regenereren via de elektronentransportketen in aanwezigheid van zuurstof is (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b), wat resulteert in de toename van 3-HP zonder duidelijke toename van 1,3-propaandiol en 2,3-butaandiol.

300-L scale-up fermentatie

Om de haalbaarheid van stam JJQ02(pUC18-kan-aldH) voor 3-HP productie in een grotere bioreactor te onderzoeken, werd fed-batch fermentatie uitgevoerd in een 300-L bioreactor volgens de fermentatieomstandigheden die in de 5-L fermentor waren vastgesteld. Er werd een tweefasige beluchtingsstrategie toegepast; de beluchtingssnelheid werd verlaagd tot de helft in het tijdstip van de zwarte pijl, zoals aangegeven in fig. 4. 3-HP bereikte 54,5 g/L met een opbrengst van 0,43 mol/mol, en de concentratie en opbrengst waren 12,2 g/L en 0,11 mol/mol voor 1,3-propaandiol, 21,3 g/L en 0,17 mol/mol voor 2,3-propaandiol, 21,3 g/L en 0,3 mol/mol voor 2,3-propaandiol en 0,4 mol/mol voor 3-HP.17 mol/mol voor 2,3-butaandiol, en 9,3 g/L en 0,11 mol/mol voor acetaat in 51 uur (fig. 4).

Vergeleken met de resultaten verkregen in de 5-L reactor, waren de titer en de molaire opbrengst van 2,3-butaandiol in de 300-L reactor duidelijk verhoogd, die vergelijkbaar waren met die met dezelfde stam in de 5-L reactor bij een constante beluchtingssnelheid van 1 vvm. Dit impliceerde dat de zuurstofoverdracht in de 300-L reactor iets hoger zou kunnen zijn dan die in de 5-L reactor met verminderde beluchtingssnelheid, omdat sommige onderzoeken hebben aangegeven dat de productie van 2,3-butaandiol een geschikte beluchtingssnelheid vereist (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). Onder de beluchtingsconditie in de 300-L reactor bevorderde de expressie van de enzymen die verband houden met 2,3-butaandiolvorming en de NADH-pool of NADH/NAD+-verhouding de 2,3-butaandiolproductie, en de expressie van DhaB en AldH zou enigszins kunnen worden beïnvloed.

Met het oog op het redoxevenwicht werd in de ldhA dhaT dubbelmutantstam NADH, gevormd in de door ALDH gekatalyseerde reactie, deels geregenereerd door de vorming van 2,3-butaandiol en andere gereduceerde metabolieten zoals ethanol en succinaat, en deels door de elektronentransportketen (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b). Daarom had de beluchtingssnelheid in de micro-aeratiegisting een aanzienlijke invloed op de eindproducten. Bij fermentatie in de 300-L reactor, hoewel de beluchtingssnelheid werd teruggebracht tot de helft van de initiële, zou de zuurstofoverdrachtssituatie nog steeds sterk kunnen verschillen van die in de 5-L reactor als gevolg van de verschillende zuurstofoverdrachtskarakteristieken, wat een traditioneel onderwerp was in bioproces scale-up. De verschillen in productverdeling in de verschillende reactoren wezen op het belang van een nauwkeurige regeling van de zuurstoftoevoer, terwijl alleen het verminderen van de beluchtingssnelheid te ruw leek. Hoewel de 3-HP titer en opbrengst lichtjes verschilden van die in de 5-L reactor, was de opschaling toch succesvol. Aangezien de prestaties van de zuurstofoverdracht in de 300-L-reactor verschilden van die in de 5-L-reactor, werd verwacht dat verdere nauwkeurige regeling van de beluchtingssnelheid in de 300-L-reactor het 3-HP-niveau zou kunnen verhogen.