Frontiers in Microbiology

Introduction

Bacteriofagen zijn in de belangstelling komen te staan van het wetenschappelijk onderzoek, daar zij een belangrijke rol spelen in bijna elke microbiële gemeenschap. Als virale predatoren van bacteriën hebben zij een aanzienlijke invloed op microbiële populaties en dynamiek in verschillende omgevingen. Er zijn verschillende reviews over de rol van bacteriofagen in verschillende habitats, zoals de zeeën of het menselijk lichaam (Clokie en Mann, 2006; Wahida et al., 2016; Łusiak-Szelachowska et al., 2017). Sinds hun ontdekking meer dan 100 jaar geleden, afzonderlijk door Frederick Twort en vervolgens door Felix D’Herelle (Salmond en Fineran, 2015), werden bacteriofagen in Oost-Europese landen gebruikt voor de medische behandeling van bacteriële infecties, terwijl in de rest van de wereld antibiotica de hoofdrol speelden (Myelnikov, 2018). Tegenwoordig, nu infecties met multiresistente bacteriën een wereldwijde bedreiging zijn geworden (Zaman et al, 2017), worden patiënten van over de hele wereld behandeld in het Eliava Institute of Bacteriophages, Microbiology, and Virology, in Tbilisi, Georgië, dat misschien wel de langste ervaring heeft met bacteriofaagtherapie (Kutateladze en Adamia, 2008), en ook in de Bacteriophage Therapy Unit van het Ludwik Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy in Wrocław, Polen (Międzybrodzki et al., 2012). De toepassing van bacteriofagen zou niet alleen een waardevolle oplossing kunnen zijn in de medische sector, maar ook op andere gebieden waar bacteriën een negatieve impact kunnen hebben.

Enkele bedrijven in de Verenigde Staten, zoals OmniLytics Inc. (Sandy, UT, Verenigde Staten) en Intralytix Inc. (Baltimore, MD, Verenigde Staten) hebben verschillende bacteriofaagproducten ontwikkeld voor de toepassing als ontsmettingsmiddel in de levensmiddelenindustrie die kunnen worden gebruikt tegen Salmonella, Escherichia coli en Listeria monocytogenes. In Europa heeft een Nederlands bedrijf Micreos BV (Wageningen, Nederland) ook bacteriofaagproducten tegen Salmonella en E. coli op de markt gebracht en een Duits bedrijf, Fink Tec (Hamm, Duitsland), gericht op E. coli (Moye et al., 2018). Bredere toepassing van bacteriofagen wordt verwacht in de voedselwaardeketen, waaronder landbouw en aquacultuur, waar een breed spectrum van uiteenlopende planten- en vispathogenen aanzienlijke economische verliezen veroorzaakt (Buttimer et al., 2017; Doss et al., 2017).

Hoewel sommige bacteriofaagproducten al worden gecommercialiseerd, moet een effectief, constant en controleerbaar proces voor bacteriofaagproductie nog worden bereikt. De produktie van fagen in laboratoria kan als een routineproces worden beschouwd, en de protocollen zijn goed gedefinieerd; deze processen zijn echter niet gemakkelijk op te schalen. Industriële entiteiten hebben het grootste belang bij het verkrijgen van betrouwbare methoden voor faagproductie die opschaling van het proces mogelijk maken. De oplossing is echter niet gemakkelijk wegens de biologische aard van het systeem en de diverse soorten interacties die zich voordoen tussen fagen en bacteriën.

Er zijn verschillende pogingen geweest om betrouwbare methoden te genereren voor bacteriofaagproductie. Sommige onderzoekers hebben een theoretische benadering gebruikt met simulatiemodellen, terwijl anderen de praktische benadering hebben gevolgd door experimenten. Dit mini-review onderzoekt geselecteerde voorbeelden van beide benaderingen, contrasteren hun belangrijkste verschillen.

Algemeenheden in Bacteriofaag Productie

De biologische aard van bacteriofagen dwingt hun reproductie in de gastheercel. Daarom vereist een methode voor de productie van bacteriofagen een productieproces dat ten minste twee bedrijfseenheden omvat: de groei van de gastheerbacterie en de vermeerdering (of infectie) van de bacteriofaag. Het is belangrijk om rekening te houden met basisparameters voor bacteriële groei en faaginfectie, zoals de geselecteerde substraten voor de bacterie en de optimale temperatuur, zowel voor bacteriële groei als voor faaginfectie, aangezien deze factoren de infectiviteit van fagen kunnen beïnvloeden (Tokman et al., 2016). Evenzo is het belangrijk om de biologie van de te produceren faag te kennen, met inbegrip van de verschillende infectieparameters zoals adsorptiesnelheid, burstgrootte en latente periode; zoals later zal worden besproken, kunnen deze parameters echter veranderen afhankelijk van de infectieomstandigheden (Santos et al., 2014). Belangrijker nog, wordt aanbevolen om een diep inzicht te hebben in de specifieke interacties die kunnen optreden tussen de bacteriële gastheer en de geselecteerde faag, zoals de aanwezigheid van een CRISPR-cas systeem in de bacterie, omdat deze factoren een sterke invloed kunnen hebben op het faaginfectieproces (Levin et al., 2013). Het verdient ook aanbeveling een niet-virulente bacteriestam als gastheer te selecteren. Bacteriofaagproductie op industrieel niveau zal grote hoeveelheden van de gastheerbacterie vereisen, dus het vermijden van het gebruik van virulente geneesmiddelresistente, en vooral multiresistente pathogenen moet verplicht zijn in een faagproductieproces (Torres-Barceló, 2018). Hetzelfde geldt voor bacteriën die prophages dragen, omdat deze tijdens het proces kunnen worden geïnduceerd, waardoor het eindresultaat verandert (Stewart en Levin, 1984).

Een betrouwbaar proces voor grootschalige bacteriofaagproductie kan zeer ongrijpbaar zijn, omdat gegevens die in een laboratorium zijn verkregen niet altijd bruikbaar zijn voor het opschalen van biologische processen (Kwok, 2010). Onderzoekers hebben geprobeerd om deze leemte op te vullen, voornamelijk door middel van studies over bacteriofaagproductie gebaseerd op computersimulaties, waarvan sommige experimenteel gevalideerd zijn. Hier zullen we eerst theoretische studies analyseren die gericht zijn op faagproductiemodellen en vervolgens geselecteerde studies die experimenteel gevalideerd zijn. Alle gevallen komen overeen met de assaycriteria voor verdere zuivering en validatie van een op bacteriofagen gebaseerd product, en sommige zijn opgenomen in beide secties (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018a).

Theoretische modellen voor bacteriofaagproductie

Om een proces van faagproductie te beschrijven door middel van een wiskundig model, is het belangrijk om de kinetische parameters te definiëren die in het model moeten worden opgenomen. De drie basisparameters voor faagproductie zijn de populaties van vatbare niet-geïnfecteerde bacteriën, met faag geïnfecteerde bacteriën, en vrije fagen (Krysiak-Baltyn et al., 2016). Hiervan uitgaande hebben verschillende modellen extra variabelen opgenomen, zoals resistente niet-geïnfecteerde bacteriën (Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018) of meerdere bacteriesoorten (Levin et al., 1977). Al deze populaties interacteren gecontroleerd door kinetische parameters geassocieerd met bacteriële groei en faaginfectie. Het wordt als bekend beschouwd welke constanten belangrijk zijn voor bacteriën; voor bacteriofagen is dit echter nog onderwerp van discussie. Men is het erover eens dat de adsorptieconstante, de latentietijd en de burstgrootte belangrijke variabelen zijn om in aanmerking te nemen; hun relevantie in het model varieert echter tussen verschillende studies. Bovendien gebruiken verschillende auteurs een verschillende nomenclatuur om de kinetische parameters te definiëren, hetgeen een van de belangrijkste moeilijkheden is om de verschillende modellen te vergelijken en de algemene kennis over dit onderwerp te verenigen. Zo wordt de adsorptiesnelheid van fagen (indicator van aan bacteriën geadsorbeerde faagdeeltjes) gewoonlijk aangeduid met het symbool “δ”; Beretta en Kuang (1998) gebruikten echter het symbool “K”, dat ook het symbool kan zijn voor Monod’s constante van substraatspecificiteit “Ks”. Andere voorbeelden van verschillende nomenclatuur zijn te vinden in tabel 1. Net als in andere biologische processen, wordt verwacht dat auteurs die werken op het gebied van faag-bacterie groeimodellen het eens zijn over een specifieke algebraïsche woordenschat of een duidelijke uitleg van termen en eenheden opnemen in hun artikelen en een duidelijke nomenclatuur, zoals onlangs verklaard door Krysiak-Baltyn et al. (2018). Op basis van de door andere auteurs gebruikte nomenclatuur (tabel 1) stellen wij het gebruik van Griekse karakters voor om de verschillende kinetische parameters bij faagreproductie te benoemen. Burstgrootte kan worden gesymboliseerd door β, adsorptiesnelheid door δ, verduisteringstijd door ε en faagverval door λ. De enige uitzonderingen zouden faagconcentratie zijn, die algemeen bekend is als “P”, en latentietijd, bekend als “L”. Uniformiteit in deze wiskundige taal zal het begrip en de data mining voor toekomstige academische of industriële beoordelaars vergemakkelijken.

Beginnend met Campbell (1961), zijn vele pogingen ondernomen om modellen van bacteriofaagproductie te beschrijven, waarin het gedrag van de faagpopulatie onder verschillende omstandigheden en methoden wordt beschreven. Tabel 1 geeft een overzicht van verschillende faagproductiemodellen, gegeven als differentiaalvergelijkingen of integraalvergelijkingen (afhankelijk van de keuze van elke auteur), met vermelding van specifieke overwegingen voor elk model.

Faagproductiemodellen zijn over het algemeen consistent in het beschrijven van de verandering van de faagpopulatie in de tijd. Dit kan worden weergegeven als een kinetische verandering in faagdeeltjes of plaquevormende eenheden (PFU) per tijdseenheid, eindconcentraties verkregen na een batchproces, of gedurende een tijdsperiode in een continu proces. Ondanks de algemene consensus verschillen deze modellen op verschillende punten. Modellen voorgesteld door Campbell (1961) en Beretta en Kuang (1998) zijn consistent in het in evenwicht brengen van faagdeeltjes met generatietermen (vrijkomen van bacteriofaagdeeltjes per tijdseenheid) en verlies van vrij bacteriofaag door adsorptie- of vervalpercentages; deze modellen zijn nuttig door hun eenvoud en het gebruik van standaard parameters voor faaggroei zoals adsorptiesnelheid, burstgrootte en latentietijd, en zijn een snelle manier om batchproductieprocessen te simuleren, maar zij zijn niet geschikt voor processen zoals resistente bacteriepopulaties of faagevolutie in de tijd. Deze modellen hebben ook de neiging om de invloed van parameters zoals burstgrootte en latente periode te onderschatten, terwijl recentere modellen het belang van deze parameters hebben aangetoond en hoe ze kunnen variëren afhankelijk van andere factoren (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018b).

Een interessant model dat onlangs is voorgesteld door Santos et al. (2014) beschouwt de invloed van bacteriële groeisnelheid op de faagadsorptieconstante en een normale verdelingsvergelijking die de waarden van de latente periode regeert, rekening houdend met de variabiliteit in deze parameters. Dit model is zeer nuttig gebleken omdat het de mogelijkheid biedt om de invloed van het substraat op de faagproductie te evalueren, en het opnemen van de bacteriële groeisnelheid in het model biedt een indirect instrument om de fysiologische toestand van de bacteriën tijdens het proces in aanmerking te nemen. De afhankelijkheid van bacteriofaaginfectieparameters van de bacteriële groeisnelheid werd later ook door andere auteurs onderzocht (Krysiak-Baltyn et al., 2018; Nabergoj et al, 2018b); Nabergoj en collega’s vonden dat de burstgrootte lineair toenam met de bacteriële groeisnelheid, terwijl de adsorptieconstante en de latente periode afnamen.

Andere modellen hebben de invloed van meerdere bacteriesoorten onderzocht, en het optreden van bacteriële resistentie (Levin et al., 1977; Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018). Hoewel het doel van deze studies niet altijd was om methoden voor faagproductie te ontwikkelen, zijn ze nuttig om mogelijke situaties te beschrijven die zich tijdens het proces kunnen voordoen. Deze modellen omvatten variabelen die verband houden met bacteriële resistentieselectie en omkeringssnelheden als functie van de bacteriële populatie (beschikbaarheid van minder of meer vatbare bacteriën in de loop van de tijd), het definiëren van omstandigheden waarin vatbare en resistente bacteriën naast elkaar kunnen bestaan, zoals een sterk selectief nadeel bij resistente bacteriën (bijvoorbeeld lagere groeisnelheid), en/of het bestaan van een ruimtelijk toevluchtsoord (of dichtheidsvluchtsoord) waar (beneden) de faag niet in staat is de bacteriën te infecteren. Chaudhry et al. (2018) boden een interessante verklaring voor hoe fagen kunnen overleven in populaties die worden gedomineerd door resistente bacteriën, door te suggereren dat deze laatste vatbare bacteriën zouden kunnen produceren bij frequenties die faagreplicatie mogelijk zouden maken. Interessant is dat dit fenomeen al eerder is gesuggereerd (Bastías et al., 2010). De generatie van faagresistente stammen in faagproductiesystemen zou een reden tot bezorgdheid kunnen zijn en zou daarom moeten worden opgenomen in de ontwikkeling van nieuwe methoden, om deze mogelijkheid tot een minimum te beperken. Verschillende auteurs hebben gesuggereerd dat dit probleem kan worden vermeden met de faagproductieopstelling, die in de volgende paragraaf zal worden besproken.

Een andere interessante studie is die van Krysiak-Baltyn et al. (2018), waarin ook variabele infectieparameters worden opgenomen als functie van de bacteriële groeisnelheid, en operationele kosten en productiviteit worden geschat in een gesimuleerd tweetraps processysteem. Een van de belangrijke conclusies van deze theoretische studie is dat de optimale substraatconcentratie voor bacteriële groei niet noodzakelijkerwijs dezelfde moet zijn voor bacteriofaagproductie, en volgens hun analyse zouden de kosten per mL fagen bij een concentratie van 4 × 1010 fagen/mL zo laag kunnen zijn als $ 1,78 × 10-2. Het zou interessant zijn deze schatting experimenteel te valideren en na te gaan hoe zij is aangepast aan verschillende economieën of landen.

Ten slotte moet ook rekening worden gehouden met de evolutie van bacteriofagen in een productieproces, aangezien de fagen hun efficiëntie om bacteriën te infecteren in de loop van de tijd kunnen vergroten of verkleinen (Lenski en Levin, 1985). Dit concept zou kunnen worden voorgesteld als infectiesnelheden in host-range experimenten, waarbij zelfs methoden voor host-range expansie kunnen worden bereikt voor faagtherapietoepassingen (Mapes et al., 2016). Deze situatie is gesimuleerd in batchculturen, waarbij is aangetoond dat het verschijnen van faagmutanten sterk afhankelijk is van de genetische flexibiliteit van fagen (mutatiesnelheden) (Levin en Bull, 2004). De mogelijkheid om de evolutie van fagen tijdens de productie te voorspellen zou nuttig zijn om een productieproces op te zetten dat de kans op wijziging van de lytische eigenschappen van fagen minimaliseert. De besproken artikelen tonen aan dat bacteriofaagproductiemodellen een belangrijke benadering zijn die kan helpen om de beste strategieën te vinden, maar ze moeten experimenteel gevalideerd worden.

Experimentele ervaringen in bacteriofaagproductie

Er zijn verschillende praktijkstudies waarbij faagproductie een rol speelt. Sommige zijn gericht op faagproductie in bioreactoren, terwijl andere zich richten op de evaluatie en optimalisatie van het proces. Zoals verwacht, wordt in deze ervaringen ook een stap van bacteriële groei en faaginfectie/propagatie in kolven en bioreactoren overwogen (tabel 2). Deze gegevens zijn nuttig om inzicht te geven in de wijze waarop bepaalde modellen van gastheer-bacteriofaag kunnen worden gebruikt voor vermeerdering en verhoging van het niveau van faagproductie. De meest gebruikte gastheer-faag systemen zijn E. coli stammen en hun fagen, waarschijnlijk door de hoeveelheid informatie betreffende deze bacterie-faag systemen (E. coli fagen T3, T4, en T7) en het gebrek aan informatie over andere bacterie-faag systemen.

Volgens één gerapporteerd geval kunnen de verkregen titers oplopen tot 1,2 × 1016 PFU mL-1 in een batchbioreactor (5 L) (Sochocka et al., 2015). Dit productieniveau komt overeen met de productie die nodig is voor therapeutische doeleinden (>1 1010 PFU mL-1), rekening houdend met zuiveringsstappen, de vervalsnelheid van fagen en de stabiliteit of houdbaarheid (Naghizadeh et al., 2018). Andere auteurs hebben ook veelbelovende productieniveaus gemeld van 5 × 1012 PFU mL-1 in 1,2 L (Warner et al., 2014), en 2,4 × 1013 PFU dag-1 in 1 L (Nabergoj et al., 2018a; tabel 2).

Het is moeilijk om vergelijkingen te maken over welke methode efficiënter zou kunnen zijn, omdat ze verschillende kweekprocedures en verschillende gastheer-bacteriofaagsystemen gebruiken. Batchcultuur is de goedkoopste (niet eenvoudigste) manier om bacteriofagen te produceren, maar zij wordt sterk beperkt door het maximumvolume van de beschikbare apparatuur, de totale bedrijfstijd en de beschikbaarheid van substraat (hogere concentraties kunnen remmend werken op de groei van bacteriën). Continue kweek is schaalbaarder wanneer de bacteriële verdunningssnelheid wordt geoptimaliseerd door wijziging van de in- en uitlaatflux. Daarnaast maakt het reguleren van de verdunningssnelheid directe controle mogelijk over de bacteriële groeisnelheid, die een directe invloed heeft op infectieparameters zoals burstgrootte, adsorptieconstante en latente periode (Mancuso et al., 2018; Nabergoj et al., 2018b). Verdunningssnelheid kan ook worden gebruikt om de productiviteit van het systeem te verhogen, zoals werd aangetoond door Nabergoj et al. (2018a) waar een maximale faagproductiviteit van 109 fagen mL-1 h-1 werd bereikt met een lage verdunningssnelheid van 2 h-1 in een 1 L cellstat-systeem. Een continu werkend systeem kan permanent operatief zijn, en is daarom de meest geschikte manier om een biotechnologisch product voor een bedrijf te produceren. Zij zijn echter moeilijk en duur te implementeren en vereisen voortdurende controle om de stabiele toestand te handhaven. Een volledig continu proces voor bacteriële groei en bacteriofaagproductie zou de kans op het optreden van bacteriofaagresistentie kunnen vergroten als er geen specifieke tegenmaatregelen worden genomen (Middelboe et al., 2001).

Sommige auteurs hebben de implementatie van processen in twee fasen voorgesteld, één uitsluitend voor de productie van bacteriën en een tweede voor de vermeerdering van fagen (Schwienhorst et al., 1996; Sauvageau en Cooper, 2010; Nabergoj et al., 2018a). Dit kan worden bereikt met een celstat-systeem, waarbij twee bioreactoren in serie zijn geschakeld met een constante stroomsnelheid door het systeem. In dit geval kunnen de stroomsnelheid tussen de reactoren en het volume in elke reactor (en de verdunningssnelheid en bacteriegroei door toevoeging) worden geregeld om een maximale productiviteit te bereiken (Nabergoj et al., 2018a). Een andere interessante opstelling voorgesteld door Sauvageau en Cooper (2010) bestaat uit een semi-continu systeem van een tweefasig, zelfcyclerend proces. In dit geval functioneert elke fase vergelijkbaar met een batchcultuur, waarbij de bacteriën eerst apart van de faag worden gekweekt, en vervolgens in de faagvermeerderingsfase worden geïntroduceerd wanneer een geschikte concentratie is bereikt, waardoor het infectieproces kan worden gestart met een gewenste multipliciteit van infectie (Kasman et al., 2002). Deze opstelling heeft ook het voordeel dat er geen permanente monitoring nodig is om de stabiele toestand van continue systemen te handhaven, en is gebruikt om een productiviteit van 7,59 × 1014 PFU mol CO2-1 te bereiken (Sauvageau en Cooper, 2010). Beide voorbeelden, het celstat-systeem en het tweefasige zelfcyclingsproces, hebben het grote voordeel dat bacteriën worden gekweekt in afwezigheid van fagen, zodat bacteriofaagresistentie niet wordt bevorderd tijdens het proces.

Tot slot is het belangrijk op te merken dat er enkele parameters zijn die niet altijd worden gerapporteerd in studies over bacteriofaagproductie. Zo worden parameters zoals beluchtingsaandeel of luchtinstroom in de bioreactor slechts in twee rapporten vermeld (Sauvageau en Cooper, 2010; Santos et al., 2014), ook al is dit een van de belangrijkste parameters bij de productie van bacteriën op industrieel niveau. Informatie over andere parameters zoals energieoverdracht, verschillend substraatgebruik, bioreactorontwerp, agitatie, propellers en constructiematerialen bij bacteriofaagproductie is schaars of onbestaande.

Eindconclusie

De herontdekking van het potentiële gebruik van fagen in een breed spectrum van toepassingen is zeer opwindend en veelbelovend. Het bewijsmateriaal suggereert dat systemen voor bacteriofaagproductie die de waarschijnlijkheid van het optreden van bacteriofaagresistentie verminderen, de voorkeur verdienen, zoals een celstat of een tweefasig zelfcyclisch proces. Met deze opties zouden ook variabelen kunnen worden beheerst om de productiviteit van het proces te verhogen. Desondanks zijn de modellen voor de productie van bacteriofagen nog lang niet ingeburgerd en kunnen zij op verschillende manieren worden verbeterd. Er zijn nog veel uitdagingen te overwinnen. Verdere studies over geoptimaliseerde grootschalige bacteriofaagproduktie, kosten van infrastructuur en apparatuur, verschillende veiligheidsaspecten en toepassingsdoseringen zijn nodig, en de ervaring leert dat deze uitdagingen moeten worden aangegaan met gezamenlijke inspanningen van academische en industriële partners.

Ten slotte is het belangrijk op te merken dat de meeste modellen voor bacteriofaagproduktie kunnen worden toegepast binnen een specifiek bereik van waarden voor parameters van faaginfectie en bacteriële groei. Daarom, ongeacht de belangrijke vooruitgang in faag productiemodellen en opstellingen, zal de diepe kennis van het specifieke faag-bacterie systeem altijd de eerste vereiste zijn om een efficiënt faag productiesysteem op te zetten.

Author Contributions

RG, SL, en RB bedachten het werk en schreven het manuscript. KG, GH, en JR schreven de delen van het manuscript. Alle auteurs hebben bijgedragen aan de bibliografische revisie, manuscript revisie, gelezen, en goedgekeurd de ingediende versie.

Funding

Dit werk werd gefinancierd door de CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133 en Postdoctorado PUCV 2018.

Conflict of Interest Statement

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Acknowledgments

RG dankt CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133. SL dankt Postdoctorado PUCV 2018.