Frontiers in Pharmacology

Introduction

Het gebruik van natuurlijke remedies is een oude traditie die nog steeds in de praktijk wordt toegepast, waarbij >60% van de wereldbevolking verschillende gezondheidsproblemen, waaronder kanker, aanpakt met traditionele geneeskunde als eerste keuze (Sultana et al., 2014). De behandeling van kanker is echter complex, en de huidige mogelijkheden voor patiënten zijn afhankelijk van het type kanker en het stadium, naast de leeftijd, het geslacht en de algehele gezondheid van de patiënt. Hoewel chemotherapie meestal succesvol is in de vroege stadia van kanker, hangt de werkzaamheid ervan af van het toedieningsschema van het geneesmiddel en de fysiologische toestand van de patiënt. Het grootste punt van zorg bij chemotherapie is echter de toxiciteit ervan, omdat de gebruikte geneesmiddelen zowel kankercellen als normale cellen kunnen aantasten, waarbij een hoge proliferatie-index tot bijkomende schade bij de patiënt leidt. Bovendien kunnen kankercellen resistentie tegen de behandeling ontwikkelen, uitzaaiingen vertonen en daardoor de respons op de behandeling verminderen en de kans op ziektevrije overleving verkleinen. Daarom is een van de belangrijkste uitdagingen bij het ontdekken van geneesmiddelen het terugdringen van de toxiciteit van chemotherapeutische middelen en het ontwikkelen van effectievere en efficiëntere geneesmiddelen om behandelingen, hersteltijden en de algehele kwaliteit van leven van patiënten te verbeteren.

Natuurlijke producten hebben een rijke bron van chemische structuren opgeleverd voor de ontwikkeling van anti-kanker behandelingen. Op het gebied van oncologische farmaceutica is 49% van de geneesmiddelen die in chemotherapie worden gebruikt, afgeleid van of geïnspireerd door natuurlijke bronnen zoals planten, micro-organismen en mariene organismen (Newman en Cragg, 2016). Voorbeelden hiervan zijn vinca-alkaloïden en taxanen (tubulinebindende agentia), naast podofylotoxinen, anthracyclinen en etoposiden (topoisomeraseremmers) (Da Rocha et al., 2001; Nobili et al., 2009). Deze voorbeelden illustreren het potentieel van natuurlijke producten bij de ontdekking van geneesmiddelen.

De AA’s zijn secundaire metabolieten die worden geproduceerd door de familie van de Annonaceae (figuur 1). In de traditionele geneeskunde wordt de vrucht van het geslacht Annona gebruikt voor de behandeling van koorts, pijn, reuma, diarree en artritis, en de bladeren voor diabetes, hoofdpijn en slapeloosheid (Moghadamtousi et al., 2015a). Annona reticulate wordt in Afrika gebruikt als een anti-dysenterische en anti-helminthische behandeling, en A. squamosa wordt in India gebruikt voor de behandeling van verschillende aandoeningen, waaronder kwaadaardige tumoren (Savithramma et al., 2011). Verder is A. muricata een populair geneesmiddel in Amerika, Afrika en India voor de behandeling van kanker (Moghadamtousi et al., 2015a), terwijl in Mexico A. macroprophyllata, A. muricata, en A. purpurea worden gebruikt voor de behandeling van huidtumoren en maagkanker (Alonso-Castro et al., 2011; Brindis et al., 2013). Volgens een etnofarmacologisch overzicht van medicinale planten in Mexico, zou het geslacht Annona ook kunnen worden onderzocht voor de behandeling van darmkanker (Jacobo-Herrera et al., 2016). Dit bewijs wijst erop dat de AA’s moleculen zijn met een aanzienlijk bioactief potentieel.

Meer dan 500 AA’s zijn tot op heden beschreven; deze verbindingen worden gekenmerkt door een lange alifatische keten met een α, β-onverzadigde γ-lactonring en 0-3 tetrahydrofuraan (THF) ringen (Yuan et al, 2015), en hebben cytotoxische activiteit laten zien tegen verschillende menselijke kankercellijnen (d.w.z. long-, borst-, colon-, nier-, pancreas-, prostaat-, lever-, en blaaskanker) (besproken in Zeng et al, 1996; Chávez en Mata, 1998; Wang et al., 2002; Yuan et al., 2003; Mangal et al., 2016; Miao et al., 2016a; Miao et al., 2016b) naast in vivo antitumoractiviteit (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b). Hierin hebben we de meest recente rapporten over AA’s op het gebied van drug discovery-oncologie beoordeeld.

Materialen en methoden

We hebben een zoekopdracht uitgevoerd in de PubMed-database met behulp van de volgende trefwoordtermen: “acetogenins and cancer,” “acetogenins antitumor activity,” “acetogenins cytotoxicity,” en “acetogenins mechanism of action,” onder andere combinaties. Wij hebben de in de laatste 15 jaar gepubliceerde artikelen beoordeeld die gebaseerd waren op twee criteria: planten met een medicinale toepassing en de bioassay-geleide fractioneringsmethodologie. De hierin gerapporteerde in vitro gegevens zijn uitsluitend gebaseerd op de activiteit van zuivere verbindingen, terwijl voor in vivo studies ook kruidenextracten in aanmerking werden genomen wegens het ontbreken van tests in diermodellen.

Resultaten en Discussie

In Vitro Studies

Op het gebied van natuurlijke producten impliceert de zoektocht naar bioactieve moleculen meestal een bioassay-geleide fractionering van extracten om de hoofdmolecule of -moleculen te vinden die verantwoordelijk zijn voor de activiteit. Vele secundaire metabolieten kunnen echter gericht zijn tegen meerdere kankeraandoeningen. In het algemeen is de farmaceutische industrie geïnteresseerd in geneesmiddelen die meer dan één moleculaire interactie vertonen en verschillende moleculaire doelwitten omvatten.

Acetogeninen zijn moleculen met een groot potentieel voor toekomstige kankertherapie. Hun meest prominente biologische activiteit is remming van het mitochondriaal Complex I als gevolg van hun bis-THF structuur. Eerder werd immers gerapporteerd dat de mono-THF AA’s met een alkylketen die het lactongedeelte met de THF-groep verbindt, niet-competitieve remmers zijn van Complex I (d.w.z. NADH: ubiquinone oxidoreductase) in de ademhalingsketen, wat leidt tot een blokkering van de fosforylatieve oxidatie en een daaropvolgende daling van de ATP-productie (Tormo et al., 1999; Chen et al., 2012). Bij een dergelijke remming is een grote groep pathways betrokken die celdood kunnen induceren, waaronder apoptose en autofagie, of in andere metabolische netwerken kunnen werken als remmers van het enzym lactaatdehydrogenase A, als antioxidant, of door de celcyclus te arresteren.

Daarnaast hebben A. muricata (Moghadamtousi et al, 2015a) en A. squamosa L. (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b; Chen et al., 2012c; Chen et al., 2016) zijn gerapporteerd dat ze cytotoxische activiteit hebben tegen verschillende menselijke of andere zoogdieren kanker cellijnen. Met name de AA’s annosquatines A (1) en B (2) vertonen selectiviteit ten opzichte van respectievelijk de MCF-7 en A-549 cellijnen (Chen et al., 2012c). Tabel 1 toont de meest recent ontdekte AA’s die cytotoxische activiteit vertonen, naast andere minder recente verbindingen die in vivo antineoplastische activiteit vertonen (tabel 2).

Apoptose is een natuurlijke strategie van celdood waarbij overbodige of beschadigde cellen worden gedood. De belangrijkste genen die bij dit proces betrokken zijn, zijn p53 en de bcl2-familie; de eerstgenoemde is een tumorsuppressor, terwijl de laatstgenoemde zowel proapoptotisch (o.a. BAD, BAX en BAK) als anti-apoptotisch (bcl2 en bcl-x) kan zijn (Okada en Mak, 2004). De belangrijkste functie van p53 is het voorkomen van de replicatie van cellen met DNA-schade. Daarom is p53 inactief, en de beschadigde cellen blijven groeien en DNA-mutaties repliceren, wat leidt tot ziekten zoals kanker (Igney en Krammer, 2002; Okada en Mak, 2004). Het tot op heden verrichte onderzoek kan derhalve in twee hoofdthema’s worden ingedeeld: mechanismen voor apoptose-inductie of apoptose-resistentie.

De huidige apoptose-inducerende chemotherapieën veroorzaken ernstige secundaire effecten bij patiënten. Daarom is het zoeken naar minder toxische geneesmiddelen een prioriteit en verwacht wordt dat natuurlijke producten kunnen helpen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen die apoptose moduleren. In deze context verhogen AA’s de activiteit van caspase 3 en 8 (apoptose-effectoren), terwijl ze de expressie van survivin en Bcl-2 verlagen, waardoor apoptose wordt bevorderd. De AA annonacine (3) bevordert apoptose in kankercellen door activering van de caspase 3 en Bax routes (Yuan et al., 2003), terwijl squamocine apoptose induceert door de expressie van de proapoptotische genen Bax en Bad, hetgeen resulteert in de splitsing van PARP en de verhoogde activiteit van caspase 3 in blaas T24 kankercellen (Yuan et al., 2006). Dit staat in contrast met eerdere resultaten waarbij squamocine geen apoptose induceerde in borstkankercellen, maar de proliferatie remde door de celcyclus in de G1-fase te blokkeren (Raynaud et al., 1999).

Het methanolextract van A. reticulata remt de expressie van caspasen 6 en 9 in dikke darm- en leverkankercellen (Mondal et al., 2007), terwijl de organische en waterige extracten van A. squamosa de expressie van Bcl-2 in MCF-7 borstkankercellen en K-562 leukemiecellen verlagen, wat wijst op hun effect als apoptose-inductoren (Pardhasaradhi et al., 2005). Bovendien induceert het bladextract van A. muricata de expressie van caspasen 3 en 9 en remt het de celproliferatie door fosfo-ERK en fosfo-AKT te verminderen in MIA PaCa-2-cellen (Yiallouris et al., 2018).

De AA’s leiden ook tot cyclusstilstand, wat implicaties heeft voor de proliferatie van tumorcellen. AA’s reguleren de celcyclus in de G1/S overgang door de expressie van cycline D1 te remmen in menselijke hepatocellulair carcinoom cellen (Qian et al., 2015). In dit verband arresteert het A. muricata-extract de celcyclus in de G1-fase en vermindert het aantal cellen in de S-fase op een concentratie-afhankelijke manier door de expressie van cycline D1, een belangrijk regulerend eiwit van de celcyclus, te verminderen (Torres et al., 2012). Een soortgelijk resultaat werd waargenomen voor squamocine, dat cellen in de G1-fase arresteert in T24 blaaskankercellen (Yuan et al., 2006). Ondanks de relevantie van de celcyclus hebben weinig studies zich gebogen over de vraag hoe AA’s dit mechanisme beïnvloeden.

Aerobe glycolyse, een mechanisme dat door tumorcellen wordt gebruikt om energie te verkrijgen in afwezigheid van zuurstof (Figueroa-González et al., 2016; García-Castillo et al., 2017), is ook een doelwit van AA’s. Verschillende eiwitten en glycolytische enzymen worden geüpreguleerd door HIF-1, een belangrijke transcriptiefactor die betrokken is bij de aerobe glycolyse van tumoren, in kankercellen. Interessant genoeg verlaagde het extract van A. muricata de expressie van HIF-1α en NF-κB en de niveaus van de glucosetransporter GLUT1 en de enzymen HKII en LDHA in pancreaskankercellen (Torres et al., 2012). Daarnaast vertoonde het bladextract van A. muricata antiproliferatieve effecten in kankercellijnen en bevorderde het de celdood door remming van de NKA- en SERCA-pompen (Yiallouris et al, 2018).

Anderzijds codeert het MDR1-gen het celmembraanglycoproteïne P, een belangrijk transporteiwit dat antikankermedicijnen uit het binnenste van cellen perst, waardoor hun intracellulaire accumulatie wordt beperkt en hun toxiciteit wordt verminderd (Figueroa-González et al., 2012). Secundaire metabolieten, zoals flavonolen, ginsenosiden, polyfenolen, alkaloïden en harsglycosiden, hebben interessante resultaten laten zien in het moduleren van P-gp in kankercellijnen (Phang et al., 1993; Beck et al., 1988; Silva et al., 2001; Jodoin et al., 2002; Zhou et al., 2004; Figueroa-González et al., 2012). Bovendien kunnen AA’s de expressie van de MDR1- en MRP1-genen in geneesmiddelenresistent humaan hepatocellulair carcinoom down-reguleren, evenals de expressie van topoisomerase IIα en glutathion S-transferaseΠ (Qian et al., 2015).

Recentelijk had autofagie de belangstelling gewekt als een mechanisme van celdood. Autofagie is een katabool proces dat eukaryote cellen activeren wanneer ze onder stress staan, zoals verhongering van de cel of de aanwezigheid van ziekteverwekkers (He en Klionsky, 2009). Tijdens dit proces recycleert de cel eiwitten of niet-functionele organellen in een meerstappenproces met lysosomale afbraak om uiteindelijk de cellulaire homeostase te herstellen (Kenific en Debnath, 2015). Als zodanig zou de ontregeling van de autofagie flux kunnen leiden tot kanker, omdat het recyclen van macromoleculen, niet-functionele organellen en eiwitten kankercellen voorziet van hoge metabolische vereisten voor celproliferatie (Kenific en Debnath, 2015; García-Castillo et al., 2017). In dit scenario is autofagie een aantrekkelijk therapeutisch doelwit geworden, en AA’s zouden in staat kunnen zijn om dit proces te remmen. Liu et al. (2012) rapporteerden dat de verbinding AA005 (een acetogenine analoog) de ATP productie remde, AMPK activeerde, en de mTOR Complex 1 pathway blokkeerde om uiteindelijk autofagie te induceren in dikke darmkankercellen, en de celcyclus in de G1 fase te arresteren. Deze verbinding is een nabootsing van de AA’s, waarbij een ethyleenglycolethereenheid de twee THF-ringen vervangt. Een dergelijke chemische modaliteit verleent een superieure biologische activiteit, een voorbeeld van de plasticiteit van AA’s dat kan worden beschouwd als een inspiratiebron om nieuwe en krachtigere moleculen te creëren met verschillende farmacologische doelen.

Antitumoractiviteit van Acetogenins in diermodellen

De gegevens betreffende de antikankeractiviteit van AA’s en de Annona-extracten zijn bijzonder veelbelovend, aangezien deze verbindingen antitumoractiviteit vertoonden in diermodellen. Studies in vivo verschaffen belangrijke informatie over de werking van het geneesmiddel in een volledig organisme en maken het mogelijk niet alleen de antitumorwerking, maar ook de toxiciteit in verschillende organen te evalueren. Belangrijk is dat de dieren experimentele onderwerpen zijn die het mogelijk maken om klinische follow-up uit te voeren, met inbegrip van de beoordeling van de klinische uitkomst, ziektevrije progressie en overleving, en ziekteherval.

Het ethylacetaatextract van A. squamosa dat rijk is aan de AA’s 12,15-cis-squamostatine-A (4) en bullatacine (5) verminderde de tumorgroei van hepatocellulaire tumoren bij muizen met een maximaal remmend percentage van 69,55% in vergelijking met de positieve controle (cyclofosfamide) (Chen et al, 2012b). Er werd gesuggereerd dat de cis-configuratie in een van de bestanddelen verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de cytotoxische activiteit van het kruidenpreparaat. Bovendien verminderde bullatacin (5) geïsoleerd uit A. squamosa in een dosis van 15 μg/kg effectief de tumorgroei in muizen die S180 en HepS xenograften droegen met respectievelijk 65,8 en 63,4%. Deze resultaten zijn superieur aan die verkregen bij gebruik van hogere concentraties taxol (40 μg/kg). Bullatacin (5) bezit een aangrenzend bis-THF-gedeelte en drie hydroxygroepen, die waarschijnlijk de bioactieve structuur vormen (Chen et al., 2012a).

De zaadolie van A. squamosa remde 53,54% van de tumorgroei in muizen die H22-cellen droegen (Chen et al., 2016) en verminderde de expressie van IL-6, Jak, en verschillende gefosforyleerde signaaltransductoren en activatoren van de transcriptie p-Stat3-pathway. Ook werd gemeld dat de α, β-onverzadigde γ-lactonmoleculen die aanwezig zijn in AA’s Michael-reactieacceptoren zijn (Ji et al., 2012), die Stat3-activering remmen, een therapeutisch doelwit dat betrokken is bij celproliferatie, apoptose, ontsteking en angiogenese (Cafferkey en Chau, 2016). Het extract van A. muricata vertraagde de tumorgroei in pancreas xenograften (Yiallouris et al., 2018), het verminderen van metastasering door verlaging van de niveaus van de metalloproteïnase-9, en het bevorderen van kankerceldood door necrose (Torres et al., 2012). In een prostaat xenograft, verbeterde het A. muricata extract verrijkt met flavonoïden de biologische beschikbaarheid en vertoonde het een lagere toxiciteit dan het extract verrijkt met AA’s (Yang et al., 2015).

Laherradurin (6) en cherimolin-2 (7) werden geïsoleerd uit de medicinale plant A. diversifolia en in vivo getest tegen baarmoederhals- en colorectale kankercellen (Schlie-Guzmán et al., 2009). Beide AA’s verminderden de grootte van HeLa tumoren met vergelijkbare waarden als die van doxorubicine; beide verbindingen vertoonden ook antiproliferatieve activiteit in vitro tegen dezelfde kankercellijn. Deze resultaten komen overeen met andere rapporten, waarin als meest actieve molecule laherradurine (6) werd gerapporteerd, dat aangrenzende bis-THF-moleculen en een β-hydroxy γ-methyl γ-lactonstructuur bezit, terwijl cherimolin-2 (7), dat een niet-aangrenzend bis-THF-molecuul en een γ-lacton-eenheid bevat, een verminderde antitumoractiviteit vertoont. Tabel 2 geeft een overzicht van de antitumoractiviteit van verschillende AA’s in diermodellen.

Toxiciteitsonderzoek

Experimenten met dieren moeten acute orale toxiciteitsprotocollen bevatten om chemicaliën te testen en tekenen van toxiciteit waar te nemen; dit minimaliseert het aantal benodigde dieren, verzekert een correcte toediening van de dosis in de experimenten, en vermijdt lijden (OECD, 2008). Tot dusver is er echter weinig informatie over de toxiciteit van AA’s of Annona-extracten. Zo bedroeg de LD50 voor het ethanolextract van A. muricata bij muizen 1,67 g/kg volgens Sousa et al. (2010). Arthur et al. (2011) rapporteerden de LD50 (<5 g/kg) van het waterige extract, waarbij zij opmerkten dat een hogere dosis de nieren zou kunnen beschadigen. Ook werd waargenomen dat het zaadextract van A. squamosa leverschade kon veroorzaken (Miao et al., 2016b), en het A. muricata extract verrijkt met flavonoïden vertoonde een verminderde toxiciteit in een prostaat xenograft (Yang et al., 2015). Cherimolin-2 geïsoleerd uit A. diversifolia vertoonde toxische effecten en dood in SW480 xenograften in doses van meer dan 5 mg/kg/dag (Schlie-Guzmán et al., 2009).

Zoals eerder uitgelegd, kunnen AA’s het complex 1 van de ademhalingsketen remmen via het transport van de elektronenketen in de mitochondriën. De AA’s voegen zich bij en blokkeren het NADH-enzym, dat gewoonlijk overexpressief is in kankercellen, waardoor de ATP-productie wordt geremd, wat uiteindelijk tot celdood leidt. Vermoedelijk suggereert een dergelijk mechanisme dat de AA’s “onschadelijk” zijn voor normale cellen; toch zouden meer studies moeten worden uitgevoerd om de selectiviteit van deze moleculen te verzekeren.

Conclusie

Chemotherapie is niet specifiek voor kankercellen; zij veroorzaakt verschillende ongewenste bijwerkingen zoals schade aan normale weefsels en organen. Het belangrijkste aspect van conventionele chemotherapie is echter dat in een aanzienlijk aantal gevallen kankercellen resistentiemechanismen ontwikkelen die tumorprogressie en metastasering mogelijk maken.

De zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen in de natuur is niet nieuw. Verscheidene derivaten van natuurlijke stoffen worden thans gebruikt om verschillende ziekten te behandelen. Zo wordt taxol (paclitaxel), dat door de traditionele kennis werd ontdekt, beschouwd als de meest winstgevende kankerbehandeling op de markt. Interessant is dat paclitaxel een antimitotisch geneesmiddel is dat de celproliferatie in celculturen remt, maar dat in tumoren multipolaire delingen induceert, hetgeen aantoont hoe een molecule verschillende werkingsmechanismen kan hebben, afhankelijk van de in vitro- of de patiëntomstandigheden. Dit alkaloïde heeft een geschiedenis van 30 jaar en illustreert de belangrijkste hinderpalen bij het werken met natuurlijke produkten, hun beperkte biologische beschikbaarheid en de produktiekosten, maar ook de ongelooflijke werkzaamheid bij het doden van kankercellen.

Acetogeninen zijn veelzijdige antikankermoleculen die via verschillende mechanismen de dood van tumorcellen veroorzaken. Zij kunnen de uitsluiting van chemotherapeutische geneesmiddelen uit kankercellen moduleren en zijn sterke apoptose-inductoren. Hun bioactieve flexibiliteit blijkt uit hun vermogen om de celcyclus te reguleren door cellen in fase G1 te arresteren, apoptose te bevorderen door de remming van verschillende eiwitten, en zelfs autofagie te induceren. Bovendien vallen hun metabolische interacties op, die specifiek verband houden met de transcriptiefactoren HIF1 en STAT3 en de repercussies daarvan op het gebied van energieverbruik, angiogenese, ontsteking en metastase. De antitumoractiviteit van AA’s in vivo is veelbelovend (bullatacin, laherradurin, en cherimolin-2 zijn voorbeelden). De preklinische gegevens zijn echter ontoereikend om een goed inzicht te krijgen in de farmacodynamiek en de kinetiek van AA’s, en er zijn meer acute toxiciteits- en oplosbaarheidstests nodig om de veiligheid te garanderen en de mogelijkheid van klinische proeven met mensen te onderzoeken. Bovendien zou de incorporatie van verschillende liganden (d.w.z. antilichamen, vitaminen en peptiden) of de bereiding van tumorspecifieke derivaten de AA-activiteit kunnen verbeteren en meer geschikte geneesmiddelen kunnen opleveren.

Plantenextracten zijn chemisch complex, en hun genezende eigenschappen hangen vaak af van de interacties tussen verbindingen en hun verhoudingen binnen het extract. Er valt nog veel te ontdekken over de effecten van AA’s bij kanker. Dit gebied biedt de mogelijkheid om nieuwe moleculen te vinden voor de behandeling van deze complexe ziekte. Het standaardiseren van extracten is daarom een mogelijk alternatief voor het gebruik van kruidensupplementen, vooral bij planten waarvan de farmacologische activiteiten gebaseerd zijn op de combinatie van meer dan één verbinding. In dit mini-review worden enkele eerder bestudeerde AA’s opgesomd die antitumor activiteit vertonen en een toekomst zouden kunnen hebben in klinisch kankeronderzoek.

Bijdragen van auteurs

NJ-H droeg bij aan de conceptie, het schrijven en de discussie van het artikel; CP-P droeg substantieel bij aan de discussie en revisie van het manuscript; VC-T bereidde alle figuren en tabellen voor; MM-V en AG-E droegen bij aan het chemische deel van het artikel; AZ-D droeg significant bij aan de moleculair biologische discussie van het artikel. Alle auteurs hebben de definitieve versie van het te publiceren manuscript besproken, herzien en goedgekeurd.

Funding

Dit werk werd gesteund door de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), Mexico (subsidienummer 285884). VC-T werd gefinancierd door CONACYT (PhD grant number 267787).

Conflict of Interest Statement

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van enige commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Aankondigingen

NJ-H dankt CONACYT voor de financiering van het project.