Genetische polymorfismen van cytochroom P450 2D6 (CYP2D6): klinische gevolgen, evolutionaire aspecten en functionele diversiteit

De farmacogenetica die zich bezighoudt met overgeërfde verschillen in geneesmiddelendoelwitten en de dispositie van geneesmiddelen in de vorm van geneesmiddelenreceptoren en -transporters, is volop in ontwikkeling.1, 2, 3, 4, 5 Momenteel is onze kennis het verst gevorderd met betrekking tot de invloed van polymorf verdeelde genen die coderen voor drugmetaboliserende enzymen, hoewel de kennis over drugreceptoren en -transporters snel toeneemt. Het grootste belang voor de interindividuele verschillen in de respons op geneesmiddelen wordt momenteel uitgeoefend door de verschillen in capaciteit voor het metabolisme van geneesmiddelen, veroorzaakt door genetisch polymorfisme of door remming of inductie van het metabolisme van geneesmiddelen. Naast geneesmiddel-geneesmiddel interacties, pathofysiologische factoren en omgevingsfactoren, speelt de genetica van de geneesmiddel metaboliserende enzymen een cruciale rol bij het begrijpen van interindividuele verschillen in geneesmiddelrespons en bijwerkingen van geneesmiddelen. De grootste invloed van de geneesmiddelenmetaboliserende enzymen wordt uitgeoefend door de cytochromen P450’s, de belangrijkste fase-I-enzymen.6, 7 Daarvan zijn CYP2C9, CYP2C19 en CYP2D6 in hoge mate polymorf en zijn zij samen verantwoordelijk voor ongeveer 40% van het fase-I- metabolisme in de lever. Daarnaast dragen ook de polymorfismen van CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6 en CYP2C8 bij tot interindividuele verschillen in het metabolisme van geneesmiddelen. CYP2D6 is wellicht het meest uitvoerig bestudeerde polymorfe enzym dat bij de mens geneesmiddelen metaboliseert; het polymorfisme ervan is van groot klinisch belang en was het eerste van de polymorfe P450’s dat op moleculair niveau werd gekarakteriseerd. Momenteel zijn er meer dan 48 verschillende drugssubstraten voor dit enzym geïdentificeerd (tabel 1) en CYP2D6 is verantwoordelijk voor ongeveer 25% van het metabolisme van bekende geneesmiddelen. Dit zou echter een lichte overschatting kunnen zijn, aangezien in het verleden specifiek is gezocht naar geneesmiddelen die door dit enzym worden gemetaboliseerd, vanwege de polymorfe expressie ervan. In dit overzicht worden de huidige kennis en gevolgen van de moleculaire genetica van CYP2D6 beschreven, alsmede de kennis van de gevolgen voor de behandeling met geneesmiddelen.

Algemene kenmerken van CYP2D6

CYP2D6 is een polypeptide van 497 aminozuren. Het enzym maakt slechts een klein percentage uit van alle lever-P450’s, maar zijn rol in het metabolisme van geneesmiddelen is veel groter dan zijn relatieve gehalte (zie Zanger et al8). De verschillende modellen van het enzym, gebaseerd op de driedimensionale structuur van cytochroom P450 BM-3 of CYP2C5, en de resultaten van site directed mutagenese verschillen sterk van elkaar. Ondanks het succes van goed afbrekende kristallen van de zoogdieren CYP2B4, CYP2C5, CYP2C9 en CYP3A4, is men er nog niet in geslaagd goede CYP2D6-kristallen te verkrijgen. Aangenomen wordt dat dergelijke kristallen noodzakelijk zijn om een sjabloon te verkrijgen voor modellen met voldoende resolutie en nauwkeurigheid om bijvoorbeeld geneesmiddelen te voorspellen die substraten voor dit enzym zullen zijn. Een dergelijk model zou van groot belang zijn voor de geneesmiddelenindustrie, omdat een geneesmiddelenontwerp waarbij stoffen met hoge affiniteit als substraat voor CYP2D6 worden vermeden, van cruciaal belang is voor een succesvol product op de markt.

CYP2D6-substraten zijn lipofiele basen met een protoneerbaar stikstofatoom. De hydroxyleringsreactie vindt plaats op een afstand van 5 of 7 Å van het stikstofatoom. Site-gerichte mutagenese-experimenten wijzen uit dat Asp301 het negatief geladen aminozuur is dat verantwoordelijk is voor binding aan het substraatstikstof.8 Daarnaast lijken ook Ser304, Thr309 en Val370 betrokken te zijn bij de substraatbinding9 , hoewel verdere modellen nodig zijn voor bevestiging.

CYP2D6 heeft een zeer hoge affiniteit voor alkaloïden (zie tabel 1).10 De expressie van het enzym wordt, in tegenstelling tot andere hepatische xenobiotische metaboliserende cytochroom P450’s, niet gereguleerd door enig bekend milieuagens en is niet induceerbaar door bekende hormonen. Aangezien er geen fenotype is beschreven bij personen die geen CYP2D6 hebben of tot 13 actieve genexemplaren hebben, zou men kunnen concluderen dat het enzym geen belangrijke endogene functie heeft. Een rol voor het metabolisme van sommige neurotransmittoren is gesuggereerd. Recent is namelijk aangetoond dat CYP2D6 een specifiek 5-methoxyindolethylamine O-demethylase is,11 en ook 5-methoxytryptamine12 blijkt een substraat te zijn. Naast dergelijke substraten speelt het enzym waarschijnlijk een belangrijke rol bij het metabolisme van voedingsbestanddelen, met name alkaloïden (zie hieronder).

De werking van CYP2D6 op substraten met potentiële activiteit in de hersenen zou een functioneel fenotype impliceren bij proefpersonen, d.w.z. slechte metaboliseerders (PM’s) die het enzym missen. In feite hebben twee studies een significant verband aangetoond tussen gedrag bij psychologische tests en de aanwezigheid van CYP2D6.13, 14 De vraag rijst of een dergelijke activiteit essentieel is. Interessant is dat Pai e.a.15 onlangs hebben aangetoond dat een gemeenschappelijke variant van het pseudogeen CYP2D7P in actieve vorm tot expressie kan komen in de menselijke hersenen, wat een functioneel enzymproduct oplevert dat actief is in het metabolisme van bijvoorbeeld codeïne. Of dit een produkt van werkelijk functioneel belang is, moet nog worden opgehelderd, hoewel de bevinding als zodanig van belang is.

CYP2D6 Polymorfisme-Historische Aspecten

Het polymorfisme van CYP2D6 werd onafhankelijk van elkaar in drie verschillende laboratoria ontdekt. Folke Sjöqvists laboratorium toonde aan dat het metabolisme van nortriptyline en desimipramine, waarvan later werd aangetoond dat zij CYP2D6-substraten waren, een enorme interindividuele variatie vertoonde in plasmaspiegels bij dezelfde dosering en er werden twee fenotypen geïdentificeerd.16 Latere studies door de Sjöqvist-groep met gebruikmaking van tweelingen toonden aan dat het verschil genetisch van aard was. Bob Smith en zijn medewerkers in Londen bestudeerden het metabolisme van twee antihypertensiva bethanidine en debrisoquine, die in gebruik waren tegen hypertensie. Toen Bob Smith in mei 1975 40 mg debrisoquine innam, werd hij duizelig, viel flauw en leed aan ernstige hypotensie. Een latere studie met 10 mg debrisoquine bij 94 proefpersonen identificeerde de twee fenotypen.17 Michel Eichelbaum in Bonn onderzocht de antiarrhytmische effecten van sparteïne en twee proefpersonen klaagden over onaangename bijwerkingen zoals wazig zien, diploida, duizeligheid en hoofdpijn. Analyse van de plasmaspiegels bracht aan het licht dat zij 4-5 maal hogere spiegels hadden dan de anderen en de twee fenotypes werden in 1978 en 1979 gepubliceerd.18, 19

De genetische basis achter het debrisoquine polymorfisme werd 10-15 jaar later opgehelderd. In een gezamenlijke studie van de laboratoria van Urs Meyers en Frank Gonzalez werden polyklonale CYP2D-antilichamen van ratten, die in Bazel waren ontwikkeld, gebruikt als hulpmiddelen om het menselijke CYP2D6 cDNA te klonen uit een menselijke lever λgt 11 cDNA-bibliotheek en het tot expressie gebrachte cDNA had de verwachte bufuralolhydroxylaseactiviteit.20 Met behulp van RFLP kon het laboratorium van Meyers veranderde RFLP-patronen in PM’s voor debrisoquine bevestigen,21 terwijl de volledige identificatie van de CYP2D6*3 en CYP2D6*4 allelen in 1990 werd gepubliceerd.22

In de late jaren tachtig identificeerden wij in vruchtbare samenwerking met Leif Bertilsson en Folke Sjöqvist een RFLP-patroon in Chinezen dat actief is in het CYP2D6-metabolisme, indicatief voor PM’s in Kaukasiërs23 en later karakteriseerden wij het meest voorkomende gedeeltelijk defecte CYP2D6-allel in Oosterse mensen, CYP2D6*10.24 Omdat een Franse groep onze grootte-identificatie van de Chinese XbaI fragmenten tegensprak, hebben wij verschillende DNA monsters opnieuw gescreend door XbaI RFLP met gebruikmaking van een lagere dichtheid van de agarose gel en vonden enkele monsters waarvan wij dachten dat ze niet-geavigeerd DNA hadden (zie Ingelman-Sundberg25 voor verdere details). Onderzoek van hun herkomst bracht echter aan het licht dat zij afkomstig waren van personen die zeer snel waren voor het metabolisme van debrisoquine en er werden personen geïdentificeerd met tot 12 extra CYP2D6-genkopieën. Dit bleek de eerste beschrijving te zijn van een stabiel versterkt actief gen bij de mens26 en de term ultrarapide metaboliseerders (UM’s) werd gedefinieerd.27 Latere onderzoeken naar de frequenties in verschillende populaties toonden 30% aan in Ethiopiërs,28 10% in Spanjaarden en 10% van de populaties in Italië en Turkije, terwijl UM’s ongebruikelijk zijn (1-2%) in Noord-Europa en in wezen afwezig in Azië (zie6 voor referenties). Bij Ethiopiërs vonden wij geen individu homozygoot voor defecte CYP2D6-genen, maar wel allelen die zowel 2, 3, 4 als 5 CYP2D6-genkopieën bevatten.28 Een soortgelijke situatie werd ook gezien bij Saoedi-Arabiërs.29 Uit een schatting van het aantal dragers van CYP2D6-genduplicaties in West-Europa blijkt dat 5,5% van de Europeanen drager is van meer dan twee actieve CYP2D6-genkopieën en UM’s zijn (tabel 2).

CYP2D6 Genetisch polymorfisme

Het CYP2D6-gen is gelokaliseerd op chromosoom 22q13.1. De locus bevat twee naburige pseudogenen, CYP2D7 en CYP2D8.30 De evolutie van de menselijke CYP2D locus heeft geleid tot eliminatie van drie genen en inactivering van twee (CYP2D7P en CYP2D8P) en gedeeltelijke inactivering van één (CYP2D6). Op dit moment zijn er meer dan 46 verschillende belangrijke polymorfe CYP2D6-allelen bekend. De aanwezigheid van sterk op elkaar lijkende, dicht bij elkaar gelegen pseudogenen met schadelijke mutaties heeft, onder meer door ongelijke crossover-reacties, geleid tot het ontstaan van veel van de CYP2D6-variant-allelen, die meestal coderen voor defecte genproducten. De “activiteit” in de CYP2D-locus is hoog in vergelijking met bijvoorbeeld de CYP2C-locus en als gevolg daarvan zijn in betrekkelijk korte tijd vele variant-allelen gevormd. De meest voorkomende variant-allelen, verspreid over verschillende etnische groepen, staan vermeld in tabel 3 en alle variant-allelen worden gepresenteerd op de home page van het menselijke CYP allelen nomenclatuurcomité (http://www.imm.ki.se/cypalleles/cyp2d6.htm). De CYP2D6-variant-allelen kunnen worden ingedeeld in categorieën, die een afgeschafte, verlaagde, normale, verhoogde of kwalitatief veranderde kataxlytische activiteit veroorzaken. Tot de belangrijkste variant behoren CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*17 en CYP2D6*41.

Het meest voorkomende allel bij Aziaten (allelfrequentie van >50%) en daarmee wellicht het meest voorkomende CYP2D6-allel ter wereld is CYP2D6*10.24 Het CYP2D6.10 enzym heeft een schadelijke P34S-mutatie, waardoor de belangrijke PPGP-sequentie die nodig is voor de vouwing van P450, wordt opgeheven, en is daardoor zeer instabiel,24 maar het heeft ook een verminderde affiniteit voor de substraten.31 Bij de zwarten is CYP2D6*17, voor het eerst beschreven in 199632 , de belangrijkste variant van het CYP2D6-allel. Het codeert naast de twee missense mutaties die in CYP2D6*2 voorkomen ook T107I, die blijkbaar een veranderde structuur van de actieve site maakt. Hierdoor ontstaat een veranderde substraatspecificiteit,33 die duidelijk is in vitro33 maar ook wanneer personen met het genotype CYP2D6*17 in vivo worden gefenotypeerd.34, 35 In het algemeen is de activiteit van het CYP2D6.17 enzym lager dan het wildtype enzym.

CYP2D6*41 is een variant van CYP2D6*2 met -1584 C in plaats van G. Het komt minder tot expressie dan het corresponderende CYP2D6*2 allel (zie Zanger et al36). Het is aannemelijk dat -1584G>C in linkage disequilibrium is met een andere SNP die deficiënte splicing van het mRNA veroorzaakt, hoewel dit nog expliciet moet worden aangetoond. Het effect in vivo van CYP2D6*41 is echter tamelijk uitgesproken en personen die homozygoot zijn voor dit allel lijken fenotypisch op personen van het intermediaire fenotype (IM) met één deficiënt CYP2D6-allel.36

Evolutie van de CYP2D-loci

Er is een drastisch verschil tussen knaagdieren en mensen wat betreft het aantal actieve CYP2D-genen. Terwijl de muis negen verschillende actieve CYP2D-genen heeft,37 draagt de mens er slechts één, die inderdaad bij 7% van de Kaukasische bevolking afwezig is (figuur 1). Van het CYP2D6-enzym is bekend dat het een zeer hoge affiniteit heeft voor plantaardige toxinen zoals alkaloïden.10 Het is redelijk om aan te nemen dat de muis de genen actief heeft gehouden vanwege een behoefte aan een ontgiftingspotentieel via de voeding, terwijl het beperktere voedsel dat de mens in het verleden tot zich heeft genomen, met inbegrip van het intellectuele vermogen om informatie over geschikt voedsel tussen generaties over te dragen, heeft geleid tot het verlies van een selectiedruk om de genen actief te houden.

Het CYP2D6-gen is niet induceerbaar in de gewone zin van het woord door een verhoogde expressie van het genproduct. Bij Drosophila vindt selectieve selectie plaats van stammen die bijvoorbeeld leven in het gebied van de Senita Cactus die giftige isoquinoline alkaloïden afscheidt en alleen de Drosophila mettleri maar geen enkele Drosophila melanogaster stam overleeft in dit gebied omdat zij in staat zijn CYP6 en CYP28 te induceren.38 Een interessante genetische selectie vindt ook plaats bij Drosophila die resistent is tegen insecticiden. Tussen 1930 en 1960 zijn insecticideresistente vlekken snel geëvolueerd. Interessant is dat de moleculair-genetische basis blijkt te bestaan uit selectie voor een insertie van een transposoom (accord-element) in de 5′-regulerende regio van het Cyp6b-gen, waardoor een 40- tot 100-voudig hogere expressie van het genproduct wordt veroorzaakt.39 Een ander mechanisme voor het verwerven van resistentie tegen insecticiden bij Drosophila wordt geïllustreerd door selectie voor drie sleutelmutaties in CYP6A2, namelijk R335S, L336V en V476L, waardoor het enzym actief wordt voor het metabolisme van DDT.40 Een illustratie van drie verschillende mechanismen voor een adaptieve reactie op substraatstress is te zien in figuur 2.

Ook wij hebben voorgesteld dat een dergelijke selectie heeft plaatsgevonden voor allelen met meerdere actieve CYP2D6-genen in Noordoost-Afrika. De basis voor deze selectie zou het vermogen van het CYP2D6-enzym zijn om alkaloïden te ontgiften, waardoor de beschikbaarheid van potentieel voedsel bij dragers van meerdere CYP2D6-genexemplaren toeneemt. Dit zou zeer gunstig zijn voor de overleving in perioden van hongersnood, wanneer slechts een fractie van de populatie in dit gebied tot wasdom komt. Onderzoek van de snelheid van het metabolisme van debrisoquine bij Ethiopiërs die in Ethiopië wonen in vergelijking met Ethiopiërs die in Zweden wonen, toonde aan dat inheemse Ethiopiërs met hetzelfde genotype trager waren in hun metabolisme in vergelijking met Ethiopiërs in Zweden, terwijl er geen significante verschillen werden gevonden in de snelheid van CYP2C19-afhankelijke katalytische reacties zoals gemeten met S-fenytoïne.41 Dit kan zo worden geïnterpreteerd dat bestanddelen in het Ethiopische voedsel, vermoedelijk alkaloïden, de CYP2D6 activiteit remmen en dat dergelijke bestanddelen inderdaad een trigger voor genetische selectie zouden kunnen zijn. Wij stellen dat de Ethiopische bevolking zich zo’n 10 000-20 000 jaar geleden zodanig uitbreidde dat voedsel een belangrijke beperking werd. Tijdens perioden van hongersnood is er een selectiedruk ontstaan ten gunste van het overleven van individuen die in hogere mate plantentoxinen kunnen ontgiften, waardoor het aantal planten dat bruikbaar voedsel kon leveren, toenam (figuur 3). Hierdoor ontstond een expansie van subpopulaties met meerdere actieve CYP2D6-genexemplaren en ook zonder inactieve CYP2D6-genen. Aangezien verreweg de meest voorkomende varianten van CYP2D6-gen die gedupliceerd en meervoudig gedupliceerd zijn, CYP2D6*2 en CYP2D6*41 zijn, die beide twee aminozuursubstituties creëren in vergelijking met CYP2D6*1, kan worden gespeculeerd dat de substraatspecificiteit van deze vorm van het enzym gunstig is voor het metabolisme van bepaalde plantaardige producten. De daaropvolgende migraties van personen uit Noordoost-Afrika naar het Middellandse-Zeegebied hebben geleid tot de hoge frequentie van UM’s in Zuid-Europa (cf. tabel 2).