Proteïne-expressie, zuivering en assay procedures van hAASS-SDH
Vector: pFB-LIC-Bse
Cellijn: DH10Bac
Tags en toevoegingen: N-terminal, TEV protease splavable hexahistidine tag
Construct eiwitsequentie:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(onderstreepte sequentie bevat vector-gecodeerde His-tag en TEV protease splitsingsplaats*)
Geoogste cellen werden geresuspendeerd in lysisbuffer (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 20 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP, 1 µL per 1 mL protease inhibitor cocktail EDTA-vrij).
Cell pellet werd opgelost in ongeveer 200 mL lysis buffer en gebroken door homogenisatie door 2 passes op 12.000 psi. De celresten werden gepelletiseerd bij 35000 xg, 1 uur en het supernatant werd gebruikt voor zuivering op een gravity flow Ni-NTA kolom (5 mL).
Gebruikte buffers worden hieronder in detail beschreven;
Binding Buffer: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 20 mM Imidazol pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Wasbuffer: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 40 mM Imidazol pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Elutiebuffer: 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycerol, 250 mM Imidazol pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Het opgehelderde celextract werd toegevoegd aan 5 ml Ni-NTA hars dat vooraf was geëquilibreerd met lysis-buffer en door een glazen kolom werd geleid. De kolom werd vervolgens gewassen met bindingsbuffer (2 x 50 ml) en wasbuffer (2 x 50 ml). Het eiwit werd geëlueerd met Elutiebuffer in 5 x 5 ml fracties. De geëlueerde fracties van kolom 1 werden samengevoegd en geconcentreerd tot 5 mL met een 30 kDa MWCO spin concentrator en geïnjecteerd in een S200 16/60 kolom (vooraf geëquilibreerd in GF Buffer (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5% Glycerol)) bij 1,0 mL/min. Fracties van 1,5 ml werden verzameld. Het geëlueerde eiwit werd ’s nachts bij 4 °C gekloofd met TEV-protease (1/20 (m/m)). De volgende dag werd het eiwitmonster op een 0,5 ml Ni-sefarosekolom geladen die vooraf was geëquilibreerd met GF-buffer om het niet-geëlueerde eiwit te verwijderen. Gepoolde eiwitfracties werden geconcentreerd tot 13 mg/mL met behulp van een 30 kDa mwco concentrator.
Activiteit assay en screening
De SDH-activiteit van hAASS werd gemeten door het volgen van NAD + reductie tot NADH, gebruikmakend van het feit dat de gereduceerde vorm van NADH fluorescerend is wanneer geëxciteerd met 340 nm licht. Wij hebben de assay overgenomen in 384-wells formaat, met detectie met de PheraStar fluorescentielezer (BMG Labtech) (excitatie/emissie = 340/480 nm). Deze assay gaf een lineaire respons met eiwitconcentraties tot 150 nM. Een typische reactie bestaat uit 100 nM gezuiverd enzym, 0,2 mM NAD+, 1,3 mM saccharopine. De reactiebuffer bestaat uit 25 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% CHAPS. De verbinding bibliotheken (LOPAC (Sigma) en NIH Clinical Collections I&II) werden gescreend in-house bij 20 uM compound concentration.
Differential scanning fluorimetry
DSF werd uitgevoerd in een 96-well plaat met behulp van een Mx3005p RT-PCR machine (Stratagene) met excitatie en emissie filters van 492 en 610 nm, respectievelijk. Elk putje bestond uit 2 µL eiwit in 2 µM DSF-buffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µL SYPRO ORANGE 1000-voudig verdund in DSF-buffer uit de voorraad van de fabrikant (Invitrogen), en (indien van toepassing) 2 µL ligand bij verschillende concentraties. Fluorescentie intensiteiten werden gemeten van 25 tot 96 ° C met een ramp rate van 3 ° C / min.
Kristallisatie
Apo kristallen werden bereid door het mengen van 50 nL van hAASS-SDH eiwit (80 mg / ml) met 100 nL reservoir oplossing met 20% PEG3350, 0,1M Tris pH 7,5 en 0,2-0,33 M natriummalonaat. NAD+-gebonden kristallen werden bereid door het mengen van 100 nL van hAASS-SDH (18 mg / ml, in molaire overmaat van NAD +) met 50 nL van het reservoir oplossing die 25% PEG3350, 0,2 M NaCl en 0,1 M tris pH 8,5 bevat. De kristallen werden cryo-beschermd in 9% butaandiol alvorens te worden ingevroren in vloeibare stikstof. Voor de fragment screening campagne, werden kristallen geweekt met verbindingen (10/50/500 mM) in de kristallisatie-oplossing aangevuld met 8% butaandiol gedurende 5-30 min, en bevroren in vloeibare stikstof.
Structuurbepalingsprocedures
hAASS-SDH apo en NAD+-gebonden kristallen behoren tot verschillende ruimtegroepen (P43212 vs P212121). De structuur van hAASS-SDH werd opgelost door moleculaire vervanging met het programma PHASER, waarbij het schimmel saccharopine reductase uit S.cerevisiae (PDB code 2AXQ) als zoekmodel werd gebruikt (38% sequentie-identiteit). Er werden twee moleculen gevonden in de asymmetrische eenheid (a.u.). Het oorspronkelijke model werd herbouwd met behulp van phenix.autobuild. Een gebonden NAD+ molecuul in de actieve plaats werd geïdentificeerd met behulp van de Fourier-verschilmethode en handmatig in de elektronendichtheid geplaatst met Coot. Om het model te voltooien werden iteratieve cycli van phenix.refine inclusief TLS-verfijning gevolgd door handmatige modelbouw voor ontbrekende residuen met behulp van coot uitgevoerd. Er werden geen NCS-restricties toegepast wegens conformationele verschillen in domein III (res 278-376) van de twee exemplaren in de a.u. Oplosmiddelatomen werden geplaatst tijdens de laatste vier verfijningsrondes met behulp van phenix.refine. Voor de fragmentscreeningscampagne werden liganden geïdentificeerd door DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) met behulp van verschildichtheidskaarten. Zwakkere binders met een lage bezettingsgraad werden geëvalueerd met behulp van PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/), gebaseerd op statistische modellen om liganddichtheid te vinden die aanwezig is in een gegeven dataset en die niet aanwezig is in de meerderheid van de datasets. Coördinaten en structuurfactoren voor alle datasets zijn gedeponeerd in de RCSB Protein Data Bank. Gegevensverzameling en verfijning statistieken zijn beschikbaar via de PDB pages.
Commercieel beschikbare reagentia
CRISPR/Cas9 knock-out plasmiden
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Cat # 10157