Abstract
Achtergrond. Het ATP-bindende cassette, subfamilie D, lid 1 (ABCD1) eiwit is een peroxisomale half-transporter die zorgt voor de afbraak van zeer lange keten vetzuren (VLCFA). Pathogene varianten van ABCD1 veroorzaken de ophoping van VLCFA’s in diverse weefsels en lichaamsvloeistoffen, wat leidt tot een aandoening die X-gebonden adrenoleukodystrofie (X-ALD) wordt genoemd. Deze aandoening wordt meestal gekenmerkt door bijnierinsufficiëntie en een hoge VLCFA-concentratie, en heeft verschillende niveaus van neurologische betrokkenheid, afhankelijk van het fenotype. Bijvoorbeeld, de Addison-only vorm van X-ALD heeft geen neurologische gevolgen, terwijl de cerebrale vorm van X-ALD vaak leidt tot ernstig sensorisch verlies, motorische functiestoornissen, cognitieve achteruitgang, en overlijden. Methoden. Een nieuw gekarakteriseerde en vermoedelijk pathogene variant in ABCD1 werd geanalyseerd met behulp van ons eiwit-informaticaplatform (PIP). Gepersonaliseerde moleculaire studies op eiwitniveau werden voltooid op genetische testgegevens, als aanvulling op de analyse en de klinische studie. Resultaten. Een geval van adrenomyeloneuropathie (AMN) bij volwassenen en een nieuwe ABCD1-variant worden gepresenteerd. Het unieke ABCD1 eiwit wordt besproken, en het geval van de proband wordt vergeleken met bestaande rapporten van AMN. Conclusies. Gegevensfusie uit meerdere bronnen werd gecombineerd in een uitgebreide benadering die een verrijkte beoordeling van de ziekte en prognose van de patiënt opleverde. Moleculaire modellering werd uitgevoerd op de variant om de klinische betekenis ervan beter te karakteriseren en de pathogeniciteit te bevestigen.
1. Inleiding
Het ATP-bindende cassette, subfamilie D, lid 1 (ABCD1) eiwit maakt deel uit van de ATP-bindende cassette transporter superfamilie, die bestaat uit transmembraaneiwitten die verantwoordelijk zijn voor het doorgeven van lipiden, metabolieten en andere moleculen tussen cellen of intracellulaire structuren. Het wordt gecodeerd door ABCD1, een gen dat zich op Xq28 bevindt. ABCD1 is een peroxisomale halftransporter die zeer langketenige vetzuren (VLCFA) in het peroxisoom invoert door ATP te binden. Niet-functionerende ABCD1 is niet in staat VLCFA’s naar het peroxisoom te transporteren om te worden afgebroken, wat leidt tot accumulatie van VLCFA’s in lichaamsvloeistoffen en weefsels. Dit abnormale niveau van VLCFA’s dient als een karakteristieke biomarker van X-gebonden adrenoleukodystrofie (X-ALD), de meest voorkomende peroxisomale aandoening. X-ALD is een genetische aandoening die voornamelijk geassocieerd wordt met demyelinisatie, neurodegeneratie en adrenocorticale insufficiëntie. Meer dan 800 varianten zijn gerapporteerd binnen het ABCD1-gen . Desondanks zijn er geen duidelijke genotype-fenotype correlaties waargenomen. Hemizygote mannen vertonen meestal de belangrijkste symptomen, terwijl heterozygote vrouwen op latere leeftijd vaak een minder grote mate van invaliditeit ontwikkelen. De drie klassieke fenotypen zijn de ziekte van Addison alleen, adrenomyeloneuropathie (AMN), en cerebrale ALD. Individuen met alleen de ziekte van Addison presenteren zich gewoonlijk met adrenocorticale insufficiëntie tussen 2 en 7 jaar oud. Neurologische degeneratie is aanvankelijk niet aanwezig, maar ontwikkelt zich vaak naarmate het individu ouder wordt. AMN begint meestal in het derde tot vierde decennium van het leven en tast vooral het ruggenmerg aan. Het klinische kenmerk is vaak progressieve beenstijfheid en -zwakte. Bijnierinsufficiëntie wordt aangetroffen bij ongeveer 2/3 van de AMN-patiënten, en cerebrale veranderingen treffen ongeveer de helft van hen. Cerebrale ALD is het meest ernstige fenotype, waarbij cerebrale demyelinisatie een snelle achteruitgang van het gehoor, het gezichtsvermogen, de motoriek en de cognitie veroorzaakt. Deze variant van X-ALD wordt meestal aangetroffen bij kinderen of adolescenten en leidt vaak tot de dood binnen 2-4 jaar na presentatie van de symptomen
Dit rapport beschrijft de geschiedenis van een proband bij wie in zijn dertiger jaren AMN werd gediagnosticeerd. Moleculaire analyse van het ABCD1 gen identificeerde een variant van onzekere betekenis bij deze persoon. Interessant genoeg is deze variant als pathogeen gerapporteerd in de ALD Mutation Database, maar informatie over het klinische geval werd niet gepubliceerd. De klinische casus van onze proband is opgenomen om de pathogeniciteit van deze ABCD1 variant beter te kunnen onderbouwen. Het Protein Informatics Platform (PIP) werd gebruikt voor uitgebreide moleculaire modellering om het belang van deze variant verder te karakteriseren en de diagnose van de proband te verduidelijken.
2. Casus (Klinische beschrijving)
De proband was een 31-jarige man die zich presenteerde voor evaluatie van een progressieve neurologische aandoening. De symptomen van deze aandoening verschenen voor het eerst 2 jaar geleden, toen de proband steeds vaker begon te struikelen. Later kreeg hij last van algemene spierzwakte en stijfheid, samen met verdere loopstoornissen. Om dit tegen te gaan, gebruikte de proband de laatste 7 maanden een rollator als hulpmiddel bij het lopen. Hij had ook urine-incontinentie ontwikkeld. Verder meldde hij hersenmist, geheugenverlies, aandachtstoornissen, angst en vermoeidheid. Als gevolg daarvan duurde het langer om basale mentale taken uit te voeren. Volgens de proband verergerde alcoholgebruik deze tekortkomingen. Ten slotte verloor de proband 20 pond sinds het begin van zijn ziekte en was hij niet in staat om weer op gewicht te komen, ondanks verwoede pogingen hiertoe. Dit gewichtsverlies was gedeeltelijk te wijten aan symptomen van misselijkheid en braken, die ’s morgens het meest voorkwamen.
Tijdens lichamelijk onderzoek was de proefpersoon niet in staat om op te staan vanuit zittende positie zonder zijn handen te gebruiken. Er werd een milde ataxische dysarthrie vastgesteld. Visuele fixatie testen toonden infrequente vierkante golf schokken. Vloeiende achtervolgingen waren saccades, en hij toonde langzame, volle saccades zowel verticaal als horizontaal. De strekreflexen waren pathologisch helder in de bovenste ledematen. De proband had ook pathologisch brisante mitotische rekreflexen in de onderste ledematen, inclusief aanhoudende clonus aan de enkels. Matig verminderde proprioceptie van de grote tenen was aanwezig. Lichte motorische neuron-distributie zwakte werd gezien in de onderste ledematen met sparing van de iliopsoas. Testen van hiel tot scheen toonden dyssynergia aan. Terwijl hij liep, keek de proband naar zijn voeten en bewoog met een verminderde pas. Zijn knieën hyperextendeerden, hij had de neiging om tenen te lopen, en af en toe gleed hij met zijn voeten. Het Romberg teken was aanwezig. Terwijl hij stond, waren er trillende bewegingen in zijn benen, voornamelijk in de quadriceps. De proband draaide 360 graden over 3 proeven, wat 9 tot 15 stappen per draai vereiste. Zijn houdingsreflexen waren abnormaal, en de “Pull” test was -3.
MRI van de hersenen was normaal, en MRI van de cervicale wervelkolom toonde bevindingen die wijzen op milde, diffuse ruggenmergatrofie. Er was geen bewijs voor subacute gecombineerde degeneratie of andere verworven ruggenmerg ziekte (figuur 1). Hij was behandeld voor de ziekte van Lyme, aangezien zijn Lyme IgM titers positief waren, maar er was geen significante verbetering opgetreden. Zijn cerebrospinale vloeistof werd beschreven als acellulair. Evaluatie van HIV, HTLV1, hepatitis C, hepatitis B, en cytomegalovirus was negatief. Familiegeschiedenis van soortgelijke symptomen kon niet worden vastgesteld, omdat de kennis van de proband over hun medische voorgeschiedenis beperkt was (figuur 2).
Het peroxisomale vetzuurprofiel van de proband werd verkregen na de voorgaande tests en beeldvorming. Abnormale concentraties van C26 : 0, C24/C22, en C26/C22 waren aanwezig, wat hemizygositeit voor X-gebonden adrenomyeloneuropathie suggereerde. Adrenocorticotroop hormoon gemeten 528 pg/mL (RR: 7,2-63). Sequencing en deletie/duplicatie analyse van het ABCD1 gen werd toen voltooid. De proband was hemizygoot voor een variant van onzekere betekenis in ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Deze variant was niet aanwezig in de ExAC online database, hoewel hij als pathogeen werd vermeld in de ALD Mutation Database. Twee vergelijkbare varianten, c.1596A>G (p.Lys533Glu) en c.1598A>G (p.Lys533Arg), zijn ook eerder gerapporteerd als klinisch significant.
3. Methoden
3.1. Structural Modeling
De sequentie van menselijke ATP-bindende cassette subfamilie D lid 1 (bekend als ABCD1) is waarschijnlijk een transporteiwit, dat een nucleotide-bindende regio heeft met een vouw die kan fungeren als een ATP-bindende subeenheid met ATPase activiteit. Het is bekend dat correcte dimerisatie vereist is om een actieve transporter te vormen. ABCD1 is een lid van de ALD subfamilie die deelneemt aan de peroxisomale vetzuurimport in organellen. Deze peroxisomale ABC-transporters zijn “half-transporters”, hetgeen betekent dat zij een partner half-transportermolecuul nodig hebben – de functionele vorm is altijd homodimeer of heterodimeer. ABCD1 wordt verondersteld de sleutel te zijn voor peroxisomaal transport of katabolisme van zeer lange keten vetzuren. Van ABCD1 is bekend dat het een wisselwerking heeft met PEX19; het wordt gecodeerd door het ABCD1-gen, dat ontleend is aan de NCBI Reference Accession Sequence: NP_000024: versie NP_000024.2, dat codeert voor de aminozuursequentie; en werd gebruikt voor computerondersteunde modellering. Monte Carlo simulaties werden uitgevoerd op de mutant om lokale regionale veranderingen voor de volledige 745 aminozuren mogelijk te maken.
De röntgenstraal verfijning voor Monte Carlo werd gebouwd met behulp van de YASARA SSP/PSSM Methode . De structuur werd ontspannen naar het YASARA/Amber krachtveld met behulp van op kennis gebaseerde potentialen binnen YASARA. De zijketens en rotameren werden aangepast met op kennis gebaseerde potentialen, gesimuleerde gloeien met expliciet oplosmiddel, en kleine evenwichtssimulaties met behulp van het verfijningsprotocol van YASARA. De volledige structuur werd gemodelleerd, waarbij eventuele hiaten of onopgeloste delen van de X-ray werden opgevuld.
Raffinage van de uiteindelijke modellen werd voltooid met behulp van ofwel de LC-MOD Monte Carlo-module van Schrodinger of de NAMD2-protocollen. Deze verfijningen begonnen met de door YASARA gegenereerde eerste verfijning en variant . De superpositie en de daaropvolgende verfijning van de overlappende regio’s levert een compleet model voor de ABCD1. De uiteindelijke structuren werden onderworpen aan energie-optimalisatie met PR geconjugeerde gradiënt met een R-afhankelijke diëlektricum.
Atom consistentie werd gecontroleerd voor alle 745 aminozuren (12.201 atomen) van de full-length wild-type model (WT) en 745 aminozuren (12.221 atomen) voor de variant, het controleren van de juistheid van keten naam, dihedralen, hoeken, torsies, non-bonds, elektrostatica, atoom-typering, en parameters. Er is een dimeermodel voorspeld, dat bestaat uit 24.402 atomen, inclusief cofactoren en ionen. Elk model werd geëxporteerd naar de volgende formaten: Maestro (MAE), en YASARA (PDB). Modelmanipulatie werd uitgevoerd met Maestro (Macromodel, versie 9.8, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010), of Visual Molecular Dynamics (VMD) . Analyses werden benadrukt op de N-terminus regio die de eerste 350 aminozuren bevat, gezien de lengte en C-term afstand van de plaats van mutatie.
Monte Carlo dynamica zoeken (hybride MC of via verbeterde MDS sampling) werd voltooid op elk model voor conformationele sampling, met behulp van methoden die eerder in de literatuur beschreven . Kort gezegd, werd elke ABCD1 variant systeem geminimaliseerd met ontspannen beperkingen met behulp van ofwel Steepest Descent of Conjugate Gradient PR, dan toegestaan aan de MC zoekcriteria ondergaan, zoals in de literatuur . Het primaire doel van MC, in dit scenario, is het onderzoeken van conformationele variabiliteit die kan optreden bij verschillende mutaties in de regio in de buurt van de mutatie en het mogelijke effect op DNA binding of verwerking met het ABCD1.
4. Resultaten
4.1. Structuur-Functie Onderzoeken
Voor WT versus de variant p.K533E vonden we de stabiliteit van het object uit energetische berekeningen voor ΔG per aminozuur relatief gelijk blijven, zodat WT een objectstabiliteit heeft van 114,67 kcal/mol∗Å2. De variant p.K533E veroorzaakt een netto toename in vrije energie van 2,321 kcal/aa∗mol∗Å2, hetgeen destabiliserend zou kunnen zijn voor de lokale regio. Deze objectstabiliteit was positief wat aangeeft dat enige dynamische veranderingen waarschijnlijk zijn met een moleculaire simulatie voor conformationele bemonstering. Daarom hebben we de lokale residuen onderzocht en vastgesteld dat een elektrostatische berekening nuttig kan zijn om de verandering in functie te verklaren. Het moleculaire model voor de volledige structuur en zijn variantvorm worden gegeven (figuur 3(a)) met behulp van onze state of the art methoden, die zijn vastgesteld . Het dimere model is cruciaal voor de functie en toont belangrijke interacties op de plaats van de mutatie die door de variantmutatie worden verstoord.
Lokale residuen binnen de 12 Å-afsnijlijn nabij de plaats van de variant (p.K533E) omvatten residuen van beide monomeren. Het monomeer dat de variant bevat (monomeer 1, grijze carbons) heeft de volgende nabijgelegen residuen met positie 533-interacties: E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535, en K624 (figuur 3(b)). Deze variant structuur (p.Lys533Glu) werd geanalyseerd en meer rechtlijnige verstoring van de lokale omgeving werd aangegeven van de positieve lysine (+) lading flipping naar een negatief glutaminezuur (-) die heel verstorend was voor de aangrenzende geladen residuen (boven). In het bijzonder worden de residuen K624, E499 en Y532 in verschillende interacties geplaatst (figuur 3(b)). De lokale ΔG per aminozuur verhoogt een netto positieve waarde die overeenkomt met een ongunstige stabiliteit in de pocket en een langere dynamica zou nodig zijn om het totale effect te bepalen, maar kan naar verwachting destabiliserend zijn. Het K533E residu heeft interessante interacties met Q472, I474, I475, en E499. K533E bevindt zich in een helix-helix gebied waar zijn geladen zijketen naar buiten wordt gepositioneerd ten opzichte van tegengesteld geladen soorten; er is ook enige helix-helix interactie met de aangrenzende helices (Figuren 3(b) en 3(c)). Dezelfde residuen zijn betrokken bij de variant, maar de positie is gewijzigd voor een aantal van de residuen, waaronder P534, P535, en K624 (figuur 3 (c)). Deze interactie zou de veranderde functie kunnen verklaren door een verandering in het dynamisch gedrag voor de lokale structurele stabiliteit (figuur 3(c)). Elektrostatische berekeningen werden voltooid voor verdere analyse (figuur 4). In het bijzonder worden residuen K624, E499 en Y532 in verschillende interacties geplaatst (figuur 3(b)). De lokale ΔG per aminozuur verhoogt een netto positieve waarde die overeenkomt met een ongunstige stabiliteit in de pocket en een langere dynamica zou nodig zijn om het totale effect te bepalen, maar verwacht kan worden dat het destabiliserend is.
4.2. Dimervormingseffecten
Het in kaart brengen van de elektrostatica werd uitgevoerd met behulp van de Poisson-Boltzmann berekening voor solvatatie op de gehele 745 aminozuurstructuur. De effecten van de veranderingen waren sterk uitgesproken op de elektrostatische verdeling met een +3 KT/E cutoff voor beide. Het WT deeltje (alle 745 aa) vertoont een duidelijke verdeling van lading rond K533, dat weinig negatief geladen regio’s vertoont en grote neutrale pockets als gevolg van de rijke hydrofobe residuen die in de bovengenoemde helices gevonden worden. De threonine mutatie lijkt de verdeling voor de ladingen te veranderen en plaatst de positie voor de negatieve ladingen verder van elkaar af, terwijl de grootte van de neutraal geladen gebieden toeneemt (Figuren 4(a) en 4(b)). De p.K533E lokale regio is geladen om de positieve lysine residu met aangrenzende glutaminezuur residuen (binnen 6 Å) (figuur 4 (b)). Omgekeerd, residu K533 heeft positieve ladingen die worden beïnvloed door residuen binnen 6 Å, namelijk E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535, en K624 (figuur 4 (a)) . De variant p.K533E lijkt geen effect te hebben op het dimeer zelf (Figuren 3 en 4), aangezien de variant zich distaal van het grensvlak tussen de monomeren bevindt. Er is echter een significante verstoring in de lokale omgeving waar de lysine van nature is ingebracht in een zak met zijn nabijgelegen residuen die tegengesteld geladen zijn en betrokken zijn in H-bindingen en zoutbrug interacties, die verloren gaat met de negatieve lading van glutaminezuur substitutie (figuur 3).
5. Discussion
Voor patiënten met AMN, zijn de opties voor behandeling momenteel beperkt. Recent onderzoek met muismodellen biedt echter een mogelijke oplossing. In X-ALD patiënten, gaat de opbouw van VLCFAs gepaard met verhoogde niveaus van radicale zuurstofspecies. Deze radicalen bevorderen de ziekteprogressie, beschadigen weefsel en veroorzaken uiteindelijk het optreden van neurologische symptomen. Muizen met X-ALD-analogen zijn met succes behandeld met een mengsel van antioxidanten, waardoor de radicaalniveaus onder controle werden gebracht en dit pathogene proces tot staan werd gebracht. Als latere proeven veelbelovend blijven, is het mogelijk dat onze proband en andere AMN patiënten op een dag op een vergelijkbare manier kunnen worden behandeld.
Hoewel onze proband presenteerde met een slecht begrepen variant in ABCD1, verschilde zijn geval niet significant van het typische AMN fenotype. De symptomen begonnen aan het eind van zijn twintiger jaren, wat precies past in het verwachte leeftijdsbereik van 20 tot 40 jaar oud. AMN heeft typisch betrokkenheid van het ruggenmerg, iets dat werd bevestigd door de MRI’s van de proband. Zijn beenzwakte en gangafwijking zijn kenmerkend voor de ziekte, net als urine-incontinentie. Braken en misselijkheid worden in verband gebracht met bijnierinsufficiëntie, terwijl de spraak- en mentale afwijkingen van de proband in verband kunnen worden gebracht met cerebrale veranderingen. Desondanks moet gezegd worden dat een patiënt met dezelfde ABCD1-variant als onze proband verschillende symptomen zou kunnen vertonen. Pathogene varianten in ABCD1 resulteren zelden in voorspelbare fenotypes-zelfs wanneer een identieke versie wordt bezeten door familieleden.
De eiwit informatica afgeleid van de statistische mechanica berekeningen toegepast op de moleculaire modellering voor de varianten versus het wildtype geeft ons duidelijke aanwijzingen voor disfunctie van het normale eiwit gedrag op een moleculair niveau dat de functie zou beïnvloeden. Zo vonden we bijvoorbeeld dat variant p.K533E een netto toename in vrije energie veroorzaakt van 2.321 kcal/aamolÅ2, wat de lokale regio binnen 12 Å van residu K533 destabiliseert. Door de lokale structuurverandering, gemitigeerd door ruggengraatresiduen en interactieveranderingen in de secundaire structuur (H-bond netwerk niet getoond), kunnen gecorreleerde bewegingen zich door de hele structuur voortplanten, wat de juiste vorming van het dimeer verder frustreert.
Door de zeldzaamheid van de ABCD1-variant van onze proband, was het commerciële laboratorium niet in staat om met zekerheid te zeggen dat de variant pathogeen is. Bovendien maakten logistieke problemen en de kleine familieomvang van de proband gezinssegregatieanalyse onpraktisch. Als gevolg daarvan kon dit proces niet worden voltooid om ons beter te helpen begrijpen wat de betekenis van zijn variant was. Gelukkig bood moleculaire modellering ons een andere mogelijkheid. Moleculaire modellering van het eiwit ondersteunde de vermoedens dat deze variant de eiwitfunctie op een klinisch significante manier zou beïnvloeden. Het was niet te vermoeden dat deze variant niet als pathogeen zou zijn geclassificeerd gezien de grove verandering in de structuur, wat sterk werd ondersteund door de PIP analyse.
6. Conclusie
In conclusie, wij rapporteren een proband met een zeldzame variant in ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Het gebrek aan informatie over deze variant weerhield het genetisch testbedrijf ervan zijn variant als pathogeen te classificeren, maar de moleculaire ladingen lijken erop te wijzen dat dit gebied van het eiwit aanzienlijk is verstoord ten opzichte van het evenwicht (figuur 3(b)). Het gebruik van het eiwitmodel leverde ook informatie op voor het grotere klinische beeld van de proband. Bovendien is één geval van pathogeniciteit van deze variant opgenomen in de ALD Mutatie Database. Al deze gegevens samen maakten een zekere diagnose van AMN mogelijk. Onze proband had typische symptomen van AMN, maar de fenotypische variabiliteit die inherent is aan ABCD1 zou kunnen leiden tot een andere X-ALD presentatie bij andere individuen die deze variant bezitten.
Afkortingen
| ABCD1: | ATP-bindende cassette, subfamilie D, lid 1 (gen) |
| VLCFA: | Very long chain fatty acids |
| X-ALD: | X-gebonden adrenoleukodystrofie |
| AMN: | Adrenomyeloneuropathie. |
Gegevensbeschikbaarheid
Datasets en materialen zijn gedetailleerd in het manuscript.
Toestemming
Alle gevolgde procedures waren in overeenstemming met de ethische normen van de verantwoordelijke commissie voor experimenten op mensen (institutioneel en nationaal) en met de Verklaring van Helsinki van 1975, zoals herzien in 2000 (5). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten voor deelname aan de studie.
Conflicts of Interest
Alle auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Authors’ Contributions
Alle auteurs hierboven hebben substantiële bijdragen geleverd aan de conceptie of het ontwerp van het werk; of de verwerving, analyse, of interpretatie van gegevens voor het werk EN het opstellen van het werk of het kritisch herzien voor belangrijke intellectuele toestemming EN gaf definitieve goedkeuring van de versie te worden gepubliceerd EN overeengekomen om verantwoordelijk te zijn voor alle aspecten van het werk in het waarborgen dat vragen met betrekking tot de nauwkeurigheid of integriteit van een deel van het werk op de juiste wijze worden onderzocht en opgelost.
Funding
Funding werd verstrekt door het Center for Individualized Medicine, Mayo Clinic die fondsen verstrekte om deze studie te voltooien.
Acknowledgment
TC dankt het Center for Individualized Medicine van Mayo Clinic Jacksonville voor ondersteuning van het onderzoek.