Nieuwe isolatietechnieken voor micro-organismen met de nadruk op laserprinten | CDhistory

Nieuwe Isolatiemethoden

Nu wordt een grote verscheidenheid van methoden gebruikt om nieuwe, voorheen niet gekweekte micro-organismen bloot te leggen. Met name worden nieuwe voedingsbodems met specifieke stoffen gebruikt; er wordt gekweekt onder verschillende fysische en chemische omstandigheden van het milieu, zoals atmosferische samenstelling, temperatuur en pH. Bovendien zijn toepassingen van verdunde voedingsbodems in combinatie met lange incubatieperioden, alsmede de gezamenlijke kweek van micro-organismen van verschillende soorten, bestudeerd. De laatste jaren zijn enkele fundamenteel nieuwe kweekmethoden ontwikkeld die gebaseerd zijn op het plaatsen van micro-organismen in de natuurlijke omgeving zonder gebruik te maken van voedingsbodems. Bij dergelijke methoden wordt gebruik gemaakt van diffusiekamers en polymeercoatings waarin microbiële cellen worden geplaatst. In dit geval ontvangen de micro-organismen alle noodzakelijke voedingsstoffen uit de natuurlijke omgeving en blijven zij daarvan geïsoleerd. De toewijzing van een nieuwe producent van antibiotica (teixobactine) met behulp van dergelijke methoden wordt als een belangrijke verwezenlijking beschouwd. Een andere benadering omvat het gelijktijdig kweken en screenen van tienduizenden en honderdduizenden bacteriële microkolonies op poreuze polymeer- of keramische isolatiechips. Voor het kweken van “niet kweekbare” micro-organismen kan ook gebruik worden gemaakt van methoden waarmee afzonderlijke cellen uit natuurlijke omgevingen kunnen worden geïsoleerd. Van deze methoden zijn de meest populaire gebaseerd op de verdunning van micro-organisme-suspensie, flowcytometrie en celsortering, lasermicrodissectie, compartimentering, en toepassing van micromanipulatoren. Naast het kweken van nog niet eerder gekweekte soorten micro-organismen, is de isolatie van afzonderlijke microbiële cellen noodzakelijk voor de studie van celfysiologie, interacties tussen cellen, alsmede voor het zoeken naar nieuwe metabolieten, zoals antibiotica en enzymen.

De moderne wetenschappelijke en technologische vooruitgang biedt veel mogelijkheden wat betreft de ontwikkeling van nieuwe methoden voor het kweken, isoleren, manipuleren en bestuderen van afzonderlijke bacteriële cellen en hun consortia. Nieuwe benaderingen kunnen het proces van het werken met micro-organismen aanzienlijk versnellen en het mogelijk maken hun meer volledige en omvattende studies uit te voeren. Er zij op gewezen dat tot dusver zeer weinig methoden zijn voorgesteld voor de positionering van bacterie-arrays met micrometer-nauwkeurigheid. In Akselrod e.a. werden driedimensionale (3D) netwerken van levende cellen in hydrogel gevormd zonder verlies van hun levensvatbaarheid met behulp van arrays van gemultiplexte holografische optische vallen (pincetten) met een ongekende nauwkeurigheid (<400 nm). Om optische vallen te vormen, werden twee lasers gebruikt: Ar+ laser (20 W, 514 nm golflengte) en continue golf Ti: Sapphire laser, afstembaar in het bereik van λ = 850-900 nm, evenals een combinatie van twee diffractie-elementen, gecombineerd met verschillende lenzen in een omgekeerde optische microscoop. Netwerken van 3T3 fibroblasten, omgeven door een ring van bacteriën, werden gevormd. De mogelijkheid om honderden Pseudomonas aeruginosa bacteriën tegelijkertijd te manipuleren in tweedimensionale (2D) en 3D arrays werd ook aangetoond. De methode van holografische optische trapping is zeer nauwkeurig, maar technisch moeilijk uit te voeren.

In de studie van Rowan e.a. wordt de methode van heterogene functionalisering van oppervlakken voorgesteld, die een lithografisch proces in vier stappen is, gebaseerd op microcontactprinten van organische monolagen, implantatie van hypervertakt polymeer, en de verdere functionalisering daarvan. Als resultaat worden structuren verkregen waarop de gerichte inoculatie van bacteriële cellen wordt uitgevoerd. Onderzoek naar celoverleving heeft aangetoond dat cellen levensvatbaar blijven op de verkregen gestructureerde oppervlakken. Er werden grote isolaten van bacteriën met 18 ± 5 bacteriën en kleine isolaten met 2 ± 1 bacteriën verkregen. Volgens dit artikel kan de gedemonstreerde methode worden gebruikt voor high-throughput screening en biosensing. Het is echter moeilijk om de heterogene functionalisering van oppervlakken met behulp van deze methode te combineren met routinematig biologisch onderzoek en de voorwaarden voor het kweken van micro-organismen (temperatuur, pH, voedingsstoffen, enz.). Het is noodzakelijk op te merken dat de taak om eenvoudige manieren te vinden om een hoge resolutie van arrays van levende bacteriën te verkrijgen met de mogelijkheid van diverse biologische studies in enkele publicaties werd opgelost. De in deze werken voorgestelde benaderingen zijn in feite de voorbodes van 3D-printing.

In een studie van Weibel e.a. werd de techniek van het stempelen van levende bacteriën op agaroseplaten voorgesteld. Bacterie-arrays werden geprint (de grootte van een enkele vlek met bacteriën >200 µm) in een gebied tot 50 cm2. Stempels van polydimethylsiloxaan (PDMS) werden geproduceerd met behulp van fotolithografische techniek. De bereikte minimumgrootte van het drukuitsteeksel was 190 µm bij een hoogte van 140 µm, wat echter ver verwijderd is van de grootte die nodig is om bacteriën te scheiden. Deze methode is snel, reproduceerbaar en handig en kan worden gebruikt om het patroon, de afstand en de oriëntatie tussen kolonies van verschillende bacteriën te controleren. In Xu et al. studie, werden levende bacteriën arrays met cellulaire resolutie afgedrukt op agarose substraat met behulp van elastomeer (PDMS) stempels met een hoge aspect ratio, verkregen door de omgekeerde in situ lithografie (RISL) methode. Figuur 1 toont de voordelen van de RISL-methode ten opzichte van de standaard ultraviolet fotolithografie. De enige beperking van de RISL-technologie is de uitsteekdiameter, die nauwelijks <1 µm kan zijn vanwege de optische diffractielimiet.

De methode van microcontact printen van bacterie arrays werkt als volgt: De druppel Escherichia coli in het kweekmedium LB wordt op agarosegel (3 gewichtsprocent in LB) gedeponeerd en op het agarosesubstraat wordt een monolaag van bacteriën gevormd (de vloeistof wordt geabsorbeerd door agarosegel). Vervolgens komt de PDMS-stempel in contact met een monolaag bacteriën die de agarosegel bedekt. De stempel wordt verwijderd, en het deel van de bacteriën blijft erop zitten. Vervolgens worden, bij contact van de stempel met de laag agarosegel (4 wt% in LB, dikte 200 µm), bacteriën overgebracht op de agaroselaag. Aldus kunnen in enkele seconden arrays van E. coli bacteriën rechtstreeks op het agarose substraat worden afgedrukt met een resolutie van micron, tot enkele bacteriën, op een groot oppervlak (cm2). Aangetoond werd dat, nadat het patroon is afgedrukt, de bacteriën blijven groeien en zich blijven delen, zoals in de omstandigheden van massacultuur, d.w.z. dat de bacteriën hun normale fysiologische gedrag behouden na het afdrukken. Ook werd aangetoond dat de agaroseconcentratie cruciaal is voor goede afdrukprestaties. Een te lage concentratie leidt tot een vervorming van het gedrukte patroon, terwijl een te hoge concentratie niet geschikt is voor het kweken van bacteriën. Om arrays van enkele bacteriën te verkrijgen, werd het effect van vermindering van de initiële bacterieconcentratie in een druppel van het kweekmedium LB bestudeerd. Voor de beginconcentraties van 109 en 108 cellen/ml werd het gemiddelde aantal bacteriën per vlek gemeten op respectievelijk 12,1 en 1,4. Bij de lage concentratie bacteriën werd een zeer smalle spreiding verkregen: 44,6% van de spots bevatte slechts één E. coli-cel en 40,1% van de spots had 0 of 2 cellen. Deze resultaten toonden aan dat het microcontactprinten de productie mogelijk maakt van regelmatige arrays van afzonderlijke bacteriën. Bovendien werd aangetoond dat deze benadering van de scheiding van bacteriële arrays het mogelijk maakt de groeisnelheid van individuele lijnen van bacteriën te analyseren. Deze methodologie biedt een eenvoudige manier voor elke gewenste ruimtelijke 2D verdeling van bacteriën en kan worden gebruikt voor zowel screening en studies van bacteriële fenotypische variatie, populatiedynamiek, en de evolutie van ecosystemen.

Een zich snel ontwikkelend gebied – sociomicrobiologie – heeft de mechanismen geïdentificeerd met behulp waarvan bacteriën deelnemen aan collaboratieve en competitieve relaties door het beïnvloeden van nabije buren door middel van fysiek contact en wijziging van de chemische samenstelling van hun gemeenschappelijke micro-omgeving. Om het gedrag van kleine microbiële aggregaten te onderzoeken, werden verschillende microverwerkingstechnologieën ontwikkeld die bacteriën beperken in microfluïdische apparaten, microresonatoren en vloeistofdruppels met ultraklein volume. De mogelijkheid om analytische systemen te integreren met microfluïdica heeft deze isolatie platforms aantrekkelijk voor high-performance screening voor antibiotica resistentie en enzymatische activiteit analyse. Bijvoorbeeld, in Eun et al., een high-performance analyse en isolatie van bacteriële cellen ingekapseld in agarose micropartikels met het gebruik van fluorescent-geactiveerde celsortering (FACS) worden beschreven. Er werden microfluïdische systemen gebruikt om monodisperse micropartikels te maken met een diameter van ≈30 µm. De afmetingen van deze deeltjes maakten ze compatibel met flowcytometrie en FACS, en de gevoeligheid van deze methoden verminderde de incubatietijd voor celreplicatie vóór het uitvoeren van de analyses. Het kleine volume van de micropartikels (≈1-50 picoliter ) minimaliseerde het aantal reagentia dat nodig was voor bacteriële studies. Dit platform maakte het mogelijk bacteriën doeltreffend toe te wijzen en te isoleren, en de combinatie van methoden te gebruiken voor een snelle identificatie van targets voor biologisch actieve kleine moleculen. Als experimentele demonstratie van deze methode werden E. coli-cellen ingekapseld in agarose micropartikels, geïncubeerd in de aanwezigheid van verschillende concentraties rifampicine, en geanalyseerd met behulp van FACS. De minimale remmende concentratie rifampicine werd bepaald, en spontane mutanten die resistent waren tegen antibiotica werden geïsoleerd met behulp van FACS en gekarakteriseerd door DNA-sequencing. Met deze aanpak konden de tijd en de hoeveelheid antibiotica die nodig waren om mutanten te isoleren respectievelijk 8 en 150 maal worden verminderd in vergelijking met traditionele microbiologische methoden waarbij gebruik wordt gemaakt van voedingsagarplaten. Aldus is deze methode belangrijk op het gebied van chemische biologie, chemie van natuurlijke producten, evenals voor de ontdekking en karakterisering van biologisch actieve secundaire metabolieten.

De hierboven genoemde benaderingen zijn nuttig geweest voor het beperken van de grootte, vorm en fysieke attributen (microhabitat); echter, geen van hen heeft de mogelijkheid geboden om de 3D-geometrie van bacteriële aggregaten of de oriëntatie van meerdere populaties willekeurig te bepalen. Bovendien beperkt het proces van celinkapseling in ultrakleine volumeholten vaak het massatransport, wat leidt tot omstandigheden die onverenigbaar zijn met groei en signaaloverdracht tussen fysisch geïsoleerde populaties. Een groeiend aantal bewijzen wijst op het belang van microkolonies in de bacteriële voortplanting; er is echter een gebrek aan hulpmiddelen voor een systematische beoordeling van het celgedrag in dergelijke gemeenschappen. Nieuwe strategieën voor het creëren van een 3D-culturele omgeving op microscopische schaal kunnen een cruciale rol spelen bij het identificeren van hoe bacteriën antibioticaresistentie en andere sociale gedragingen in kleine dichte aggregaten beheren.

In Connell et al. en Connell et al. wordt de methode van laservorming van microscopische 3D-kamers op basis van multiphoton-lithografie (MPL) beschreven. De MPL methode heeft een hoge doorvoercapaciteit en de mogelijkheid om arbitraire patronen te produceren. Het biedt mogelijkheden voor de industriële productie van 3D microdevices zoals micro-optische componenten, scaffolds voor weefsel engineering, en microfluïdische chips. In de studie van Connell et al. werd boviene serumalbumine (BSA), een zeer oplosbaar eiwit dat kan worden verknoopt tot poreuze, duurzame en biocompatibele hydrogels, gebruikt om microscopische 3D bacteriekamers te maken. Enkele afzonderlijke bacteriën werden ingesloten in de BSA-kamers met een volume van 1 pl en werden vervolgens gekweekt in klonale populaties. Door de diffusie van biologisch significante moleculen en antibiotica door de wanden van BSA, evenals de uitwisseling van quorum-gevoelige signalen, werd het sociale gedrag van bacteriële gemeenschappen bestudeerd in relatie tot de grootte en dichtheid van de populatie, de vorm van de container, en de stroomsnelheid van de omgeving.

In het menselijk lichaam bestaan bacteriën meestal in gestructureerde 3D-gemeenschappen die bestaan uit verschillende bacteriesoorten. Om gedetailleerde informatie te krijgen over het effect van geometrie op pathogeniciteit, wordt in Connell et al. een 3D-printstrategie beschreven voor bacteriële gemeenschappen, waarbij fysisch verschillende maar chemisch interactieve populaties van een bepaalde grootte, vorm en dichtheid in principe in elke vorm kunnen worden georganiseerd (figuur 2). Met deze aanpak werd aangetoond dat de stabiliteit van één pathogene bacteriesoort tegen het antibioticum de resistentie van de tweede soort kan versterken vanwege hun 3D-relaties. Met behulp van laser-lithografische techniek werden microscopische containers van maximaal 1 pl volume met een containerwanddikte tot 2 µm rond geselecteerde bacteriën gesuspendeerd in gelatine gevormd door verknoping van de polypeptidemoleculen in het brandpuntgebied als gevolg van niet-lineaire absorptie van laserstraling door fotosensibilisatormoleculen. Het resultaat van deze multiphotonabsorptie is de vorming van singletzuurstof, die intramoleculaire en intermoleculaire covalente cross-linkingreacties tussen BSA en gelatine stimuleert. De unieke fysische en chemische eigenschappen van gelatine hebben de belangstelling gewekt voor het gebruik ervan voor een verscheidenheid van toepassingen, waaronder opslag, immobilisatie en 3D-kweek van bacteriën. Na verwijdering van de overmaat reagens worden de bacteriën gelokaliseerd in verzegelde holten gevormd door vernette gelatine, dat een zeer poreus materiaal is en een snelle groei van volledig ingesloten celpopulaties ondersteunt. Het is gemakkelijk doorlaatbaar voor polypeptiden, antibiotica, en voor de fysische en chemische signalen met behulp waarvan interactie tussen bacteriën plaatsvindt. Het isoleren van cellen in microcontainers biedt de mogelijkheid tot het inbedden van verschillende soorten/dichtheden containers in elkaar, alsmede tot dynamische veranderingen in de oriëntatie van de volledige populaties bacteriën binnen de gemeenschap.