3D Printed Bionic Ears | CDhistory

Het ontwerp en de implementatie van bionische organen en apparaten die de menselijke mogelijkheden te verbeteren, bekend als cybernetica, is een gebied van toenemende wetenschappelijke belangstelling.1,2 Dit gebied heeft de potentie om op maat gemaakte vervangende onderdelen voor het menselijk lichaam te genereren, of zelfs organen met mogelijkheden die verder gaan dan wat de menselijke biologie normaal gesproken biedt te creëren. In het bijzonder zou de ontwikkeling van benaderingen voor de directe multidimensionale integratie van functionele elektronische componenten met biologisch weefsel en organen een enorme impact kunnen hebben in de regeneratieve geneeskunde, protheses, en mens-machine interfaces.3,4 Onlangs hebben verschillende rapporten de koppeling van elektronica en weefsels beschreven met behulp van flexibele en/of rekbare planaire apparaten en sensoren die zich aanpassen aan weefseloppervlakken, waardoor toepassingen mogelijk zijn zoals biochemische sensoren en sonderen van elektrische activiteiten op oppervlakken van het hart,5 longen,6 hersenen,7 huid8 en tanden.9 Het bereiken van naadloze driedimensionaal verstrengelde elektronische componenten met biologische weefsels en organen is echter aanzienlijk uitdagender.4

Weefselmanipulatie wordt geleid door het principe dat een verscheidenheid aan celtypes kan worden overgehaald tot de synthese van nieuw weefsel als ze worden gezaaid op een geschikte driedimensionale hydrogel scaffold binnen een overeenkomstige groeiomgeving.10-15 Na in vivo of in vitro cultuur, weefselstructuren vormen die de morfologie van de oorspronkelijke scaffold bezitten.16 Echter, een grote uitdaging in de traditionele tissue engineering benaderingen is het genereren van cel-gezaaide implantaten met structuren die natief weefsel nabootsen, zowel in anatomische geometrieën en intra-weefsel cellulaire distributies.17 Technieken zoals het zaaien van cellen in niet-klevende mallen of zelf-vouwende steigers zijn gebruikt om drie-dimensionale weefsel constructies met complexe 3D geometrieën te fabriceren.18,19 Toch zijn de bestaande technieken nog steeds niet in staat om op eenvoudige wijze orgaan- of weefseldelen te maken met de vereiste ruimtelijke heterogeniteit en nauwkeurige anatomische geometrieën om het tekort aan donororganen voor transplantatie op te vangen.20-22 Zo blijft bijvoorbeeld de totale reconstructie van het uitwendige oor met autogeen kraakbeen – met als doel een oor te herscheppen dat er ongeveer hetzelfde uitziet als de contralaterale oorschelp – een van de moeilijkste problemen op het gebied van de plastische en reconstructieve chirurgie.23

Toevoegbare productietechnieken zoals 3D-printen bieden een potentiële oplossing door de mogelijkheid om snel computer-aided design (CAD) modellen te maken door ze in lagen te snijden en de lagen op te bouwen met behulp van biologische cellen als inkt, in de precieze anatomische geometrie van menselijke organen.24-27 Varianten van 3D-printen zijn gebruikt als methode voor vaste vrije vorm fabricage, hoewel het gebruik ervan voornamelijk beperkt is gebleven tot het maken van passieve mechanische onderdelen.24,28 3D-printen op basis van extrusie is gebruikt om harde weefselscaffolds te maken, zoals kniemenisci en tussenwervelschijven, compleet met ingekapselde cellen.29-31 Deze techniek biedt de mogelijkheid om ruimtelijk heterogene multi-materiaal structuren te creëren door gebruik te maken van depositie gereedschappen die een breed scala aan materialen kunnen extruderen.32 Verder maken nanoschaal functionele bouwstenen veelzijdige bottom-up assemblage mogelijk van macroschaal componenten die afstembare functionaliteiten bezitten. Dit zou kunnen zorgen voor het gelijktijdig printen van nano-elektronische materialen en biologische cellen om driedimensionaal geïntegreerde cyborg weefsels en organen met unieke mogelijkheden.33,34

Hier introduceren we een conceptueel nieuwe aanpak die de bovengenoemde uitdagingen aan te pakken door volledig verweven functionele elektronische componenten met biologisch weefsel via 3D printen van nano-elektronische materialen en levensvatbare cel-zaaide hydrogels in de precieze anatomische geometrie van menselijke organen. Aangezien elektronische circuits de kern vormen van zintuiglijke en informatieverwerkende apparaten,35 maakt in vitro kweken van de gedrukte hybride architectuur de groei mogelijk van “cyborg organen” die verbeterde functionaliteiten vertonen ten opzichte van de menselijke biologie. Onze benadering biedt de mogelijkheid om ruimtelijk heterogene constructies te definiëren en te creëren door een breed scala aan materialen in een laag-voor-laag proces te extruderen totdat de uiteindelijke stereolithografische geometrie compleet is. Dit concept van het 3D-printen van levende cellen samen met elektronische componenten en deze te laten uitgroeien tot functionele organen vertegenwoordigt een nieuwe richting in het samenvoegen van elektronica met biologische systemen. Dergelijke cyborg organen onderscheiden zich van gemanipuleerd weefsel of conforme planaire/flexibele elektronica en bieden een unieke manier om een driedimensionale fusie van elektronica met weefsel te bereiken.

Als een proof of concept van deze aanpak, evalueerden we de mogelijkheid van 3D-printen om een levensvatbare oorschelp te creëren die ook elektronica bevat die alternatieve mogelijkheden voor het menselijk gehoor mogelijk maakt. Menselijke organen die voornamelijk uit kraakbeenachtig weefsel bestaan, zoals de oorschelp, zijn geschikte prototypekandidaten om de haalbaarheid van onze aanpak te onderzoeken. Dit is te wijten aan 1) de inherente complexiteit van de anatomische geometrie van het oor, waardoor het moeilijk is om bio-engineer via traditionele tissue engineering benaderingen, evenals 2) de eenvoud in zijn kraakbeen weefsel niveau structuur als gevolg van het ontbreken van vasculature.23,36 Bovendien bottom-up assemblage van nano-elektronische matrices biedt de mogelijkheid om hiërarchisch genereren van functionele macroschaal elektronische componenten. Specifiek demonstreren we 3D printen van een chondrocyten gezaaid alginaat hydrogel matrix met een elektrisch geleidende zilver nanodeeltje (AgNP) toegediend inductieve spoel antenne, het aansluiten op cochlea-vormige elektroden ondersteund op siliconen. Het resultaat is een driedimensionale integratie van functionele elektronische componenten binnen de complexe en precieze anatomische geometrie van een menselijk oor (Fig. 1).

De volgende stappen zijn bij het proces betrokken. Eerst wordt een CAD-tekening van het bionische oor (fig. 1A) gebruikt om de anatomische geometrie en de ruimtelijke heterogeniteit van de verschillende functionele materialen voor te schrijven. Zoals hierboven beschreven, bevatten drie materialen de drie functionele bestanddelen (structureel, biologisch en elektronisch) van het bionische oor. Deze materialen worden ingevoerd in een spuit extrusie gebaseerde Fab@Home 3D printer (The NextFab Store, Albuquerque, NM) (Fig. 1B). De geprinte bio-elektronische hybride oorconstructie wordt vervolgens in vitro gekweekt om kraakbeenweefselgroei mogelijk te maken en een cyborgoor te vormen met de mogelijkheid om elektromagnetische signalen in het radiofrequentiebereik (RF) te detecteren door middel van een inductiespoel die fungeert als een ontvangstantenne (figuur 1C).

Om onze aanpak te demonstreren, hebben we de bionische oorconstructie als volgt geprint. Voor de steiger, we vooraf ingezaaid een alginaat hydrogel matrix met levensvatbare chondrocyten bij een dichtheid van ~ 60 miljoen cellen / ml (zie Ondersteunende Informatie). Alginaat matrix is drie dimensionaal stabiel in cultuur, niet-toxisch, pre-seeding en extrusie compatibel, en een geschikte cel levering voertuig omdat verknoping kan worden geïnitieerd voorafgaand aan depositie.37 Chondrocyten gebruikt voor het afdrukken werden geïsoleerd uit het gewrichtskraakbeen van een maand oude kalveren (Astarte Biologics, Redmond, WA). Een CAD-tekening van een menselijk oor oorschelp in stereolithografie formaat (STL) met een geïntegreerde cirkelvormige spoel antenne aangesloten op cochlea vormige elektroden werd gebruikt om de afdruk paden te definiëren door het snijden van het model in lagen van contour en raster vullen paden. De verknoping werd geïnitieerd in de alginaat-hydrogel matrix, voorgezaaid met levensvatbare chondrocyten, die vervolgens werd 3D-geprint samen met geleidende (AgNP-geïnfundeerde) en niet-geleidende silicone-oplossingen (Movie 1). Samen, deze methode produceerde de biologische, elektronische en structurele componenten van het bionische orgaan in een enkel proces.

Figuur 2A toont de 3D-geprinte bionische oor onmiddellijk na het afdrukken. Opmerkelijk, is het gevonden om trouw te reproduceren de CAD-tekening, in de exacte ruimtelijkheid voor elk materiaal zoals gedicteerd door het ontwerp. De geprinte oorconstructie werd ondergedompeld in chondrocytenkweekmedia met 10% of 20% foetaal runderserum (FBS), dat om de 1-2 dagen werd ververst (zie Ondersteunende Informatie). De hybride oor toonde een goede structurele integriteit en vormvastheid onder cultuur (Fig. 2B). Na verloop van tijd werd de constructie geleidelijk ondoorzichtiger; dit was het duidelijkst na vier weken cultuur, en is grosso modo consistent met de ontwikkeling van een extracellulaire matrix (ECM). De bruto morfologie van het bionische oor na 10 weken in vitro cultuur wordt getoond in de ondersteunende informatie.

Levensvatbaarheid werd getest onmiddellijk voor en tijdens de verschillende stadia van het drukproces. De initiële levensvatbaarheid van cellen werd bepaald na het kweken met behulp van een Trypan blauwe cel uitsluiting assay (Corning Cellgrow, Mediatech, VA) en bleek 96,4 ± 1,7% (Fig. 2C) (zie Ondersteunende Informatie). De gedrukte cel-gezaaid alginaat oor werd ook getest met een LIVE/DEAD ® Levensvatbaarheid Assay (Molecular Probes, Eugene, OR) en vertoonde een levensvatbaarheid van de cellen van 91,3 ± 3,9% met een homogene chondrocyt distributie. Dit resultaat suggereert dat het drukproces, met inbegrip van cel inkapseling en depositie, niet merkbaar invloed chondrocyten levensvatbaarheid.

Met name deze aanpak van het afdrukken van een pre-seed hydrogel matrix elimineert de grote problemen in verband met zaaien diepte beperkingen en niet-uniforme zaaien in traditionele methoden voor het zaaien voorgevormde 3D scaffolds. Het inzaaien van chondrocyten in een bio-resorbeerbare alginaatmatrix en het vormgeven ervan via 3D-printen lokaliseert de cellen naar een gewenste geometrie, waardoor nieuwe ECM-productie op gedefinieerde locaties mogelijk wordt wanneer gekweekt in voedende media. Als weefsel ontwikkelt, wordt het polymeer steiger geabsorbeerd (Fig. 2D), zodat het nieuwe weefsel behoudt de vorm van het polymeer waarin de cellen werden gezaaid. De biologisch afbreekbare steiger biedt elke cel een betere toegang tot voedingsstoffen en een efficiëntere verwijdering van afvalstoffen.

Volgende, histologische evaluatie werd gebruikt om de morfologie van chondrocyten in het neokraakbeen van het bionische oor te vergelijken met die van het inheemse kraakbeenachtige weefsel. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring onthulde een uniforme verdeling van de chondrocyten in de constructies (Fig. 2E) (zie Ondersteunende Informatie). Histologie van het oorweefsel met Safranin O kleuring gaf een relatief uniforme accumulatie van proteoglycanen in het gekweekte oorweefsel (Fig. 2F). Deze biochemische gegevens zijn consistent met de ontwikkeling van nieuw kraakbeen.38 Ten slotte werden fluorescente metingen gebruikt om de levensvatbaarheid van het 3D-geprinte bionische oorweefsel na te gaan na 10 weken in vitro groeikweek met behulp van fluoresceïne diacetaat (FDA) en propidiumjodide (PI) vlekken. Figuren 2G en 2H tonen het weefsel dat de spoelantenne bedekt en het interne weefsel dat in contact staat met de elektrode die loodrecht door het weefsel loopt, respectievelijk. In beide gevallen, de gekweekte kraakbeen vertoonde een uitstekende morfologie en weefsel niveau levensvatbaarheid. Met name deze benadering van het kweken van weefsel in de aanwezigheid van abiotische elektronische materialen kan de immuunrespons van het gekweekte weefsel minimaliseren.

Wij hebben vervolgens de mechanische eigenschappen van het kraakbeen in verschillende stadia van de groei gekarakteriseerd, aangezien de ECM-ontwikkeling sterk correleert met de mechanische eigenschappen van het zich ontwikkelende weefsel.39 Eerst werden uitgebreide biochemische en histologische karakteriseringen uitgevoerd. Monsters werden verwijderd uit culturen met 10% en 20% FBS op 2, 4, 6, 8 en 10 weken en bevroren om DNA-gehalte van het neocartilage en voor biochemische evaluatie van de ECM (zie Ondersteunende Informatie) te meten. ECM accumulatie in de constructies werd geëvalueerd door kwantificering van de hoeveelheid van twee belangrijke componenten van ECM: 1) hydroxyproline (HYP) als een marker van collageengehalte, en 2) gesulfateerd glycosaminoglycan (GAG) als een marker van proteoglycanen. Tegen week 10 steeg het HYP-gehalte tot 1,2 ± 0,1 μg/mg en 1,4 ± 0,2 μg/mg voor culturen die respectievelijk 10% en 20% FBS bevatten (Fig. 3A). De overeenkomstige waarden van het GAG-gehalte voor week 10 bedroegen 10,6 ± 0,6 μg/mg en 12,2 ± 1,0 μg/mg (fig. 3B). Deze toename van GAG en HYP inhoud geeft aan dat chondrocyten zijn levend en metabolisch actief in cultuur.

Next, werden de trek eigenschappen geanalyseerd door het testen van 3D-geprinte chondrocyten-alginaat dogbone monsters op verschillende punten in de cultuur, waarin de dogbones bevatte dezelfde celdichtheden en identieke kweekomstandigheden als het oor (Zie Ondersteunende Informatie). Evaluatie van de mechanische eigenschappen bleek dat de Young’s modulus van de dogbones steeg met de tijd van 14,16 kPa tot 111,46 kPa op week 10 (Fig. 3C). Dogbones van een lagere chondrocyt dichtheid van 20 miljoen cellen / ml werden ook getest onder vergelijkbare omstandigheden om het effect van de initiële chondrocyt dichtheid in de mechanische eigenschappen van het gekweekte weefsel te begrijpen. Deze bleken een lagere Young’s modulus van 73,26 kPa op week 10 te bezitten. Vervolgens werd de hardheid van het gekweekte kraakbeenweefsel van de 3D-geprinte oorschelp gekarakteriseerd met behulp van nano-indentatiemetingen. De indrukkingen werden uitgevoerd op de verschillende anatomische plaatsen van de oorschelp (Fig. 3D). Zoals aangetoond in Tabel 1, bleken deze hardheidswaarden relatief uniform te zijn, variërend van 38,50 kPa tot 46,80 kPa, wat de structurele integriteit van het geprinte oor bevestigt.40