Structural Implications
Het resultaat van modificatie van het cysteïne-bevattende mutante eiwit (K41C) met broomethylamine is een enzym dat vrij nauw verwant is aan het wild-type RNase A. Toch is de waarde van kcat/Km voor katalyse door K41S-ethylaminocysteine RNase A slechts 8% van die van het wild-type enzym. Het verschil in de twee eiwitten moet liggen in de verschillen tussen een thioethergroep en een methyleengroep. Hoewel de hoeken van C-S-C bindingen meestal scherper zijn dan die van C-CH2-C bindingen, wordt dit verschil gecompenseerd door de grotere lengte van C-S bindingen.3g,14 Moleculaire modellering geeft aan dat de primaire amine groepen in S-ethylaminocysteine en lysine binnen 0.1 Å over elkaar heen kunnen liggen. Een belangrijker verschil tussen S-ethylaminocysteine en lysine is hun relatieve voorkeur voor gauche in plaats van anti torsiehoeken.15 De anticonformatie van CC-CC-bindingen wordt in modelverbindingen met ongeveer 0,8 kcal/mol bevoordeeld.16 De gemiddelde K41-torsiehoek is (175 ± 3)° in het complex van RNase A met cyclisch 2′,3′-uridine-vanadaat (U>v), een vermoedelijk overgangsstatus-analoog (figuur 2). In tegenstelling tot CC-CC bindingen is de gauche-conformatie van CS-CC bindingen met 0,05-0,20 kcal/mol gunstig.17 Moleculaire modellering geeft aan dat de CS-CC binding van een S-ethylaminocysteine residu op positie 41 in de gauche-conformatie kan liggen zonder de structuur van het natieve eiwit te verstoren. De thioether zijketens op positie 41 zijn dus waarschijnlijk minder stijf en verlengd dan de alkyl zijketens. Wij veronderstellen daarom dat de katalyse door het S-ethylaminocysteïne enzym niet zo efficiënt is als die door wild-type RNase A vanwege de entropische kosten van het fixeren van een thioether in de all anti conformatie.
Structuur van de actieve plaats van RNase A gebonden aan uridine 2′,3′-cyclisch vanadaat. De structuur is verfijnd tot 2,0 Å op basis van röntgen- en neutronendiffractiegegevens van kristallen die zijn gegroeid bij pH 5,3. De zijketen van fenylalanine 120 en de uracilbasis zijn niet afgebeeld.
De katalytische efficiëntie hangt af van de lengte van de zijketen van residu 41. RNase A-varianten met een aminogroep aan het eind van een zijketen die langer is dan die van lysine zijn actievere katalysatoren dan ongewijzigd K41C RNase A. Er wordt dus extra lengte getolereerd in de actieve site. Toch zijn enzymen waarin een aminogroep op positie 41 met 4 atomen is gescheiden van de hoofdketen actiever dan enzymen die met 5 atomen zijn gescheiden. Dit resultaat zou kunnen voortvloeien uit de extra conformatie-entropie of ongunstige torsiehoeken van langere zijketens.
Er wordt geen significant voordeel behaald als residu 41 een tweede waterstofbrug kan afstaan. Guanidino en acetamidino groepen hebben de mogelijkheid om gelijktijdig met meer dan één zuurstof van een fosforylgroep te interageren. Zo wordt een guanidinogroep gebruikt om fosforylgroepen te binden door het HIV-1 Tat-eiwit18 en door kunstmatige receptoren.19 Verder blijkt in Staphylococcen nuclease en ribonucleasen van de T1-familie een arginine de rol van K41 in RNase A te spelen.20 Wij hebben K41 vervangen door een arginineresidu en een S-acetamidinoresidu, dat een kort analoog van arginine is. De waarden van ΔΔG‡ voor deze enzymen zijn lager dan die voor de analoge enzymen met alleen een primaire aminogroep in de zijketen van positie 41. Eén waterstofbrug blijkt dus voldoende te zijn voor een efficiënte katalyse. Dit resultaat is consistent met het kristallijne complex van RNase A met U>v (figuur 2). De vanadylgroep in U>v is bij benadering een trigonale tweepyramide met twee niet-bruggende equatoriale oxygenen, O1V en O3V. Zuurstof O1V accepteert een waterstofbrug van de zijketen van glutamine 11 terwijl O3V een waterstofbrug accepteert van de hoofdketen van fenylalanine 120. Alleen O1V is in staat om een waterstofbrug te accepteren van K41.
Mechanistische implicaties. De katalytische rol die gewoonlijk aan K41 wordt toegeschreven is het stabiliseren van de overmaat aan negatieve lading die tijdens de splitsing van RNA op de niet-bruggende fosforyl-oxygenen wordt opgebouwd (Figuur 2). De opbouw van lading zou kunnen plaatsvinden in een pentacoordinaat overgangstoestand (of fosforaan intermediair) wanneer de 2′ hydroxylgroep het fosfor aanvalt, op weg naar de verplaatsing van het 5′ nucleoside. Aangenomen werd dat deze stabilisatie optreedt door coulombische interacties.12c,21 Maar recent werd ook voorgesteld dat de stabilisatie optreedt door middel van een korte, sterke waterstofbrug waarbij een proton van K41 gedeeltelijk wordt overgedragen.22
De meest in het oog springende kenmerken van een lysineresidu zijn zijn positieve lading en zijn vermogen om waterstofbruggen af te staan. Drie van de 5 halfsynthetische enzymen en K41R hebben deze eigenschappen gemeen. Het is niet eenvoudig een onderscheid te maken tussen een interactie die uitsluitend gebaseerd is op coulombische krachten en een die gebaseerd is op waterstofbruggen tussen twee geladen soorten. Wat volgt is de eenvoudigste verklaring die consistent is met de gegevens in tabel 1.
Het onderscheid tussen waterstofbruggen en coulombische krachten komt nergens duidelijker naar voren dan in een vergelijking van het S-ethyltrimethylaminocysteïne enzym, dat een terminale positieve lading bezit maar geen mogelijkheid heeft om een waterstofbrug af te staan, en het S-acetamidocysteïne enzym, dat een amide N-H heeft voor potentiële waterstofbrugdonatie maar geen positieve lading heeft. De lage katalytische activiteit van het S-ethyltrimethylaminocysteïne enzym pleit sterk tegen de werkzaamheid van coulombische krachten in de stabilisatie van de overgangstoestand. Als al het andere gelijk is, neemt de energie van een lading-lading interactie alleen af als het omgekeerde van de afstand. Een grotere afstand tussen de positieve lading op de zijketen en de fosforyl oxygenen, vergeleken met die in het S-ethylaminocysteïne enzym, wordt opgelegd door de methylgroepen. Toch is het onwaarschijnlijk dat deze afstand groot genoeg is om de waargenomen >103-voudige verlaging van de kcat/Km te veroorzaken, vooral omdat de drie methylgroepen gemakkelijk in de buurt van de fosforyl-oxygenen kunnen worden ondergebracht (figuur 2).
De sterkte van een waterstofbrug zal naar verwachting omgekeerd evenredig correleren met de pKa van het proton dat wordt afgestaan, aangezien waterstofbruggen een zekere mate van protonoverdracht met zich meebrengen.23 Zoals blijkt uit tabel 1, corresponderen verhogingen van de pKa inderdaad met dalingen van de ΔΔG‡ voor halfsynthetische enzymen met zijketens van vergelijkbare lengte. Voor de halfsynthetische enzymen waarvan de lengte van de zijketens vergelijkbaar is met die van lysine, is de correlatie echter niet-lineair. Dit gebrek aan lineariteit zou het gevolg kunnen zijn van het feit dat de pKa van elke zijketen afhangt van zijn specifieke omgeving in het natieve eiwit. Zo is de pKa van Lys41 vastgesteld op 9,0,24 in plaats van 10,6 zoals vermeld voor het butylammoniumion in tabel 1. Verschillende zijketens kunnen in verschillende mate worden beïnvloed. Een andere, wellicht belangrijkere bron van niet-lineariteit is dat geladen soorten de neiging hebben deel te nemen aan sterkere waterstofbruggen dan niet-geladen soorten. Dit fenomeen is waargenomen bij eiwitten25 en bij kleine moleculen, waaronder amines.26 Vergelijking van halfsynthetische enzymen met zijketens die isosterisch zijn maar verschillen in formele lading zou een dergelijke tendens aan het licht moeten brengen. Bijvoorbeeld, in de S-acetamidinocysteine en S-acetamidocysteine enzymen zijn de zijketens op positie 41 identiek met uitzondering van een van de twee heteroatomen die aan de eindkoolstof vastzitten. Toch is het verschil in het vermogen van deze twee isologe zijketens om zich aan de overgangstoestand te binden groter dan verwacht wordt op grond van hun zuurgraad alleen. Hier is de waterstofbrug van een geladen acetamidine 4 kcal/mol sterker dan die van een ongeladen amide. Deze waarde is consistent met andere gegevens over de relatieve sterkte van geladen en ongeladen waterstofbruggen in eiwit-ligand interacties.21 Tenslotte is het opmerkelijk dat hoewel de S-acetamido zijketen een formele lading mist en een relatief hoge pKa heeft, deze toch (zij het bescheiden) bijdraagt aan de katalyse. Dit resultaat levert verder bewijs voor het belang voor de katalyse van een waterstofbrug gedoneerd door residu 41.