Een belangrijke posttranslationele modificatie van histonen is acetylering van ɛ-aminogroepen op geconserveerde lysineresiduen die aanwezig zijn in de amino-terminale staarten van deze eiwitten. Acetylering neutraliseert de positief geladen lysines en beïnvloedt daardoor de interacties van de histonen met andere eiwitten en/of met DNA. Histonacetylatie wordt reeds lang in verband gebracht met transcriptioneel actief chromatine en is ook betrokken bij histonafzetting tijdens DNA-replicatie (1, 2). De eerste klonering van een histon acetyltransferase (HAT) gen, het gist HAT1 gen, werd gerapporteerd in 1995 (3). Vervolgens werd gesuggereerd dat het HAT1-eiwit cytoplasmatisch is en betrokken is bij de afzetting van histon (4), hoewel het ontbreken van fenotypes van gist-HAT1-mutanten, evenals recent bewijs dat zowel het menselijke als het gist-enzym nucleair zijn (ref. 5; S. Tafrov en R.S.,
Een belangrijke doorbraak op dit gebied was de zuivering en klonering van HAT A, een HAT uit de macronucleus van het ciliate Tetrahymena (6). De sequentie van HAT A toonde aan dat het vergelijkbaar was met een bekende transcriptionele coactivator uit gist, GCN5. Sedertdien hebben talrijke studies aangetoond dat GCN5 (en het verwante P/CAF) geconserveerde HATs zijn waarvan de activiteit op nucleosomen de initiatie van transcriptie vergemakkelijkt (besproken in ref. 7). Interessant is dat GCN5 zelf vrije histonen kan acetyleren (in het bijzonder Lys-14 van H3) maar geen nucleosomen. Acetylering van nucleosomen door GCN5 vereist dat het in een van de twee grote eiwitcomplexen zit die Ada en SAGA heten in gist (8). De laatste jaren is aangetoond dat verschillende zoogdiereiwitten, die niet verwant zijn aan GCN5 maar ook een rol spelen bij transcriptionele activering, HAT-activiteit bezitten. Hiertoe behoren CBP/p300, TAF250, ACTR, en SRC-1 (9-12). Het wordt dus duidelijk dat histonacetylering van nucleosomen een belangrijke component is van het genactiveringsproces in meerdere stappen.
In dit nummer van de Proceedings rapporteren Trievel et al. (13) de kristalstructuur van het katalytische HAT-domein van gist GCN5. Dit domein omvat de residuen 99-262 van het 439-aa eiwit. Een deel van hun structuur, bestaande uit vier antiparallelle β-strengen (β1-4), gevolgd door een α-helix (α3) en nog een β-streng (β5), is afgebeeld in fig.1.1. Dit deel van GCN5 lijkt qua structuur sterk op dat van gist HAT1 (14), en ook op twee andere N-acetyltransferasen waarvan de substraten geen histonen zijn, namelijk aminoglycoside 3-N-acetyltransferase (AAT; ref. 15) en serotonine N-acetyltransferase (16). Al deze enzymen zijn lid van een familie van eiwitten die door sequentieanalyse zijn geïdentificeerd als eiwitten die overeenkomsten vertonen met bekende N-acetyltransferasen zoals GCN5, en daarom de GNAT superfamilie worden genoemd (17). De leden van deze superfamilie hebben als gemeenschappelijk kenmerk dat zij een acetylgroep van acetyl-CoA overdragen op een primaire aminogroep, zij het dat de verschillende enzymen zeer verschillende aminogroepen hebben; d.w.z, op ɛ-aminogroepen op lysines in het geval van HAT’s, op α-aminogroepen op de N-termini van eiwitten in het geval van enzymen zoals ARD1 of MAK3, op suikers in het geval van AAT (15) en GNA1 (18, 19), of op serotonine voor serotonine-N-acetyltransferase (16). Alle leden van de GNAT superfamilie hebben een geconserveerd motief dat motief A wordt genoemd (in rood weergegeven in Fig.1),1), en de meeste hebben twee andere geconserveerde motieven die B en D worden genoemd.
Ribbon diagram van GCN5 dat de geconserveerde kern toont die in vier N-acetyltransferases en in een N-myristoyl transferase wordt gevonden. Motief A van de GNAT superfamilie is in rood weergegeven. Acetyl CoA zoals aanwezig in HAT1 is gemodelleerd in de GCN5 structuur. De zwavel in acetyl-CoA is weergegeven in geel.
Voorspeld werd dat de geconserveerde motieven in de GNAT superfamilie betrokken zouden zijn bij het binden van acetyl-CoA omdat dit het enige substraat is dat deze diverse N-acetyltransferases gemeen hebben (17). De structuur van HAT1 met gebonden acetyl-CoA bevestigde inderdaad dat motief A betrokken is bij de binding van CoA (14), net als het structurele werk met aminoglycoside 3-N-acetyltransferase (15) en serotonine N-acetyltransferase (20). In Fig.11 is acetyl CoA gemodelleerd in de GCN5 structuur, gebaseerd op zijn positie in HAT1 (13, 14). Het acetyl-CoA is gebonden in een V-vormige spleet, gevormd tussen β-strengen 4 en 5. Het zeer geconserveerde motief A van de GNAT familie bindt aan het pyrofosfaat gedeelte van acetyl-CoA. De pantothenaat en β-mercaptoethanolamine eenheden van CoA zijn georiënteerd langs β4 en waterstofgebonden daaraan, waardoor een β-streng wordt nagebootst.
Trievel et al. (13) stellen een mechanisme voor voor de katalyse door GCN5. Zij suggereren dat een glutamaat residu (Glu-173) gepositioneerd is om een proton te onttrekken aan een NH3+ groep op het te acetyleren lysine, zodat de ongeladen aminogroep dan een nucleofiele aanval kan uitvoeren op de carbonyl koolstof van de reactieve thioestergroep van acetyl CoA. Fig. Fig.22 toont een superpositie van de vermoedelijke active-site regio’s van GCN5 (in geel) en HAT1 (in rood) met gebonden acetyl-CoA. Merk opnieuw op hoe structureel gelijk de twee eiwitten zijn in deze regio. Volgens het voorstel van Trievel et al. zou Glu-173 van GCN5, vooral na heroriëntatie van zijn zijketen, dicht genoeg bij de inkomende lysine zijn om basekatalyse uit te voeren. Inderdaad, mutatie van Glu-173 naar Gln heft de activiteit in vivo en in vitro op (13). Er is geen Glu of Asp residu op de corresponderende positie in HAT1. We merken echter op dat Glu-255 of Asp-256 van HAT1 op de aangrenzende β-streng van de spleet zodanig gepositioneerd zijn dat ze dezelfde katalytische functie zouden kunnen vervullen (Fig. (Fig.2).2). Deze residuen zijn nog niet gemuteerd.
Superpositie van β4-α3-β5 van GCN5 (geel) en de overeenkomstige regio van HAT1 (rood). De eiwitten worden weergegeven als Cα-sporen met gebonden acetyl-CoA. Glu-173 van GCN5, waarvan wordt aangenomen dat het betrokken is bij de katalyse, is weergegeven in bal en stok weergave, net als residuen Glu-255 en Asp-256 van HAT1.
Uit de structuren van GCN5, HAT1, en twee andere leden van de GNAT superfamilie blijkt duidelijk dat ze een geconserveerde kern delen, inclusief de bindingsplaats voor acetyl-CoA (Fig. (Fig.1).1). Interessant is dat N-myristoyltransferase een vergelijkbare structuur heeft als de hierboven besproken N-acetyltransferases (21, 22), ook al brengt dit enzym een veel grotere acylgroep over van myristoyl-CoA naar α-aminogroepen van glycines aan de N-termini van substraateiwitten. Anderzijds heeft chlooramfenicolacetyltransferase, dat een hydroxylgroep acetyleert, geen vergelijkbare structuur. Het lijkt erop dat de GNAT enzymen die aminogroepen acetyleren op verschillende substraten allemaal op een vergelijkbare manier acetyl-CoA binden, en misschien een vergelijkbaar katalytisch mechanisme hebben. Natuurlijk zullen deze enzymen verschillen in de gebieden die het te acetyleren substraat binden. Wat de HAT’s betreft, zal het volgende doel zijn een structuur te bepalen met een histon- of peptidesubstraat gebonden aan het enzym.