Procedure
Prospectieve deelnemers werden beoordeeld met gestructureerde interviewinstrumenten om te bepalen of ze in aanmerking kwamen voor inclusie in de studie. De Academic and Medical History Questionnaire (20) werd gebruikt voor het verkrijgen van demografische informatie en informatie over academisch niveau, huidige en vroegere medische aandoeningen, en medicatie- en middelengebruik. Mensen met diabetes, een stoornis in het middelengebruik of een gediagnosticeerde psychiatrische of neurologische aandoening werden uitgesloten, evenals mensen die medicijnen gebruikten die de uitkomstmaten zouden kunnen beïnvloeden, zoals benzodiazepines. De mate van geheugenstoornis werd bepaald met de Clinical Dementia Rating (CDR), die de deelnemer en een informant (meestal de echtgenoot of een volwassen kind) om informatie vraagt over de aard en de mate van cognitieve achteruitgang zoals die tot uiting komt in alledaagse activiteiten thuis en in de gemeenschap (21). De domeinen geheugen, oriëntatie, probleemoplossing, gemeenschapszaken, activiteiten thuis en persoonlijke verzorging werden geëvalueerd, en de beoordelingen voor elk domein droegen bij tot een globale CDR-classificatie waarbij het geheugendomein het zwaarst woog. CDR classificaties omvatten geen stoornis, lichte achteruitgang, en lichte, matige, en ernstige dementie. Wij namen personen op met een lichte achteruitgang die overeenkomt met een milde cognitieve stoornis en sloten personen uit met een CDR-classificatie die aangeeft dat er geen sprake is van stoornis en personen met milde, matige en ernstige dementie. Naast de globale CDR classificatie, werd ook de som van de boxen score afgeleid. Deze score vertegenwoordigde de rekenkundige som van de categoriebeoordelingen over de zes domeinen van functioneren en diende als een middel om het algemene niveau van functionele achteruitgang te kwantificeren (22).
Wild bosbessensap werd commercieel bereid uit rijpe, bevroren wilde (lowbush) bosbessen (Vaccinium angustifolium Aiton) door Van Dyk’s Health Juice Products Ltd (Caledonia, Nova Scotia, Canada) en werd voor dit onderzoek ter beschikking gesteld door de Wild Blueberry Association of North America, Old Town, ME, VS. De bessen werden ontdooid, geperst, gefilterd, gepasteuriseerd en vervolgens gebotteld in amberkleurige glazen flessen van een liter. Eén kg bosbessenfruit leverde ongeveer 735 ml sap van één sterkte op.
Analyses werden uitgevoerd op monsters van het sap dat in deze studie werd gebruikt. De meest voorkomende opgeloste componenten in het sap van wilde blauwe bosbessen waren glucose, fructose, en appel- en citroenzuur (23). Colorimetrische metingen van de totale hoeveelheid fenolen in het sap gaven een concentratie aan van 2,38 galluszuurequivalenten/L (24). De belangrijkste fenolen in het sap waren de hydroxycinnamzuur-ester, chlorogeenzuur met ongeveer 734 mg/L, en de flavonoïde anthocyanen met 877 mg cyanidine 3-glucoside-equivalenten/L sap op basis van HPLC-analyse zoals elders beschreven (25). Verlies van anthocyanen en andere fenolen in bosbessensap kan optreden tijdens de opslag. Tijdens de ongeveer drie maanden durende opslag van de sapmonsters werden verliezen in het totaal aan fenolen en anthocyanen vastgesteld van respectievelijk 23% en 20% voor sap dat onder koeling in amberkleurige flessen werd bewaard.
De dagelijkse consumptie werd tussen 6 ml/kg en 9 ml/kg gehouden door gebruik te maken van een doseringsschema dat werd bepaald aan de hand van het lichaamsgewicht. Personen met een gewicht van 54 tot 64 kg kregen 444 ml/dag voorgeschreven, personen met een gewicht tussen 65 en 76 kg 532 ml/dag en personen met een gewicht tussen 77 en 91 kg 621 ml/dag. Tabel 1 bevat gegevens over de inname van fenolen en anthocyanen uit monsters van het bosbessensap dat in deze studie werd gebruikt. Deze dosering kwam overeen met de hoeveelheid die in proeven met Concord druivensap bij mensen werd gebruikt (19,26). De deelnemers aan het onderzoek waren blind voor het supplement dat ze kregen en kregen te horen dat het studieproduct druivensap, bosbessensap of een placebodrankje met bessen kon zijn. Het sap werd in een koelruimte bij 4 °C bewaard voordat het werd uitgedeeld. De proefpersonen werden geïnstrueerd het sap thuis in de koelkast te bewaren en de voorgeschreven dagelijkse hoeveelheden in gelijke, verdeelde doses in te nemen bij de ochtend-, middag- en avondmaaltijd. Wij verstrekten recipiënten met individuele doseringen die voor elke proefpersoon waren gemarkeerd om het risico van verkeerde metingen te minimaliseren. De interventie duurde 12 weken. Ondanks het feit dat dit voor mensen een veel kleiner percentage van de totale levensduur is dan voor knaagdieren, verwachtten wij dat de biologische respons binnen ongeveer dezelfde tijdspanne zou optreden, gezien de overeenkomst tussen eerdere studies bij mensen en bij dieren. In experimenten met oudere dieren is aangetoond dat de cognitieve prestaties verbeteren als Blueberry’s gedurende een vergelijkbare periode worden gesupplementeerd (12,14). Daarnaast hebben studies bij mensen met bessensap van deze duur gunstige veranderingen aangetoond in ontstekingsmarkers en antioxidantcapaciteit (26).
Tabel 1
Dagelijkse inname van bosbessensap op basis van gewicht, totaal fenolgehalte en anthocyaninen.
Lichaamsgewicht, kg | Blauwbessensap inname, mL/d | Fenolen, g galluszuur eq. | Anthocyaninen, g cyanidine 3-glucoside eq. |
---|---|---|---|
54-64 | 444 | 1.056 | 0.428 |
65-76 | 532 | 1.266 | 0.512 |
77-91 | 621 | 1.478 | 0.598 |
De proefpersonen kregen sap in flessen bij het basisbezoek en bij een tussentijds bezoek tijdens week 6 van de interventie. De naleving van het consumptieprotocol en de bijwerkingen werden beoordeeld door wekelijkse telefonische contacten en door directe interviews tijdens de tussentijdse en laatste bezoeken. De proefpersonen kregen de instructie om bessenvruchten en -sappen en bessenextracten gedurende de proef te vermijden en kregen een lijst van te vermijden voedingsmiddelen en supplementen. Op deze lijst stonden vruchten en dranken zoals bosbessen, bramen, kersen, druiven, druivensap, granaatappels, aardbeien en wijn.
Evaluaties werden uitgevoerd op de basislijn vóór de behandeling en tijdens de laatste week van de interventie. De primaire uitkomsten waren metingen van de geheugenfunctie, waaronder de Verbal Paired Associate Learning Test (V-PAL; 27) en de California Verbal Learning Test (CVLT; 28). Gepaarde associate taken hebben mensen met progressieve neurodegeneratie geïdentificeerd en gevoeligheid aangetoond voor vroege en meer gevorderde ziekte van Alzheimer (29), en van de V-PAL is aangetoond dat deze gevoelig is voor veranderingen in ontwikkelingsprestaties tussen jonge, middelbare en oudere vrouwen (30). Deze taak vraagt de proefpersoon om nieuwe associaties te leren tussen gewone één- en tweelettergrepige semantisch ongerelateerde woorden (bijv. help-jaar). De V-PAL-prestatiescore is het cumulatieve aantal correcte antwoorden gesommeerd over vier leer- en testtests. De CVLT is een veelgebruikte taak voor het leren en oproepen van lijsten, die gevoelig is gebleken voor leeftijdsgebonden geheugenveranderingen, MCI en dementie (31). Het gaat om een 16-item lijst van gewone woorden die kunnen worden gegroepeerd in semantische categorieën. Er wordt echter niet gevraagd om nieuwe associaties te coderen. De vrije recall score werd gebruikt om de retentie van de woordenlijst te beoordelen. Beide tests voor verbaal geheugen werden opgenomen omdat ze enigszins verschillende cognitieve eisen stellen. Terwijl de V-PAL de vorming van nieuwe associaties vereist, gaat het bij de CVLT om de acquisitie en retentie van een lijst van individuele woorden. Beide doen een beroep op hippocampale verwerking, hoewel de gepaarde associatietaak mogelijk meer middelen vergt en mogelijk gevoeliger is voor cognitieve verouderingseffecten (32).
Verschillende vormen van elke geheugentaak werden gebruikt bij het basis- en eindbezoek, zodat de specifieke testonderdeelinhoud niet werd herhaald. Het gebruik van alternatieve vormen vermindert praktijkeffecten die geassocieerd worden met test-hertest ontwerpen aanzienlijk, in het bijzonder met betrekking tot geheugentests (33). Alternatieve formulieren kunnen echter de prestatiewinst bij de hertest gerelateerd aan procedurele oefeneffecten niet elimineren; dat wil zeggen, vertrouwdheid met de testprocedure (34).
Moed werd beoordeeld met de Geriatric Depression Scale (GDS; 35), een 30-item inventarisatie ontworpen om symptomen van depressie bij oudere volwassenen te evalueren. We maten ook gewicht en tailleomtrek, en verkregen nuchtere bloedmonsters voor de bepaling van serumglucose- en insulinewaarden door het biochemielaboratorium van het General Clinical Research Center (GCRC) aan de Universiteit van Cincinnati.
De primaire statistische analyses omvatten afhankelijke steekproef t-tests om verandering te bepalen van baseline tot laatste bezoek in geheugenprestaties, stemming, lichaamsantropometrie, en metabole parameters. Wij stelden de α waarschijnlijkheid van type 1 fout in op 0,05 om statistisch significante effecten te rapporteren. Gezien de voorlopige aard van deze proef, rapporteerden wij trends bij α ≤ 0,10. We berekenden ook Cohen’s d effectgrootte statistieken (36) voor deze analyses, die worden gekarakteriseerd als klein (0,2), middelgroot (0,5), en groot (0,8).
Omwille van bezorgdheid over prestatiewinst bij herhaalde geheugentests, voerden we ook analyses van covariantie (ANCOVA) uit om te controleren voor mogelijke procedurele praktijkeffecten door de geheugenprestaties van de blauwe bessen steekproef te vergelijken met die van de druiven placebo steekproef uit de begeleidende studie. Deze analyses isoleerden het effect van de interventie door de uitkomstscores van het eindbezoek als afhankelijke maat te gebruiken en de corresponderende score van het basisbezoek als covariate maat (37). Cohen’s f (36) vertegenwoordigt de effectgrootte statistiek voor deze analyses, die klein (0,1), middelgroot (0,25), en groot (0,40) zijn.