Pyrosequencing is een methode voor DNA-sequencing (het bepalen van de volgorde van nucleotiden in DNA) op basis van het “sequencing by synthesis”-principe, waarbij de sequencing wordt uitgevoerd door detectie van de nucleotide die door een DNA-polymerase wordt geïncorporeerd. Pyrosequencing berust op lichtdetectie op basis van een kettingreactie bij het vrijkomen van pyrofosfaat. Vandaar de naam pyrosequencing.
Het principe van pyrosequencing werd voor het eerst beschreven in 1993 door Bertil Pettersson, Mathias Uhlen en Pål Nyren door de vaste fase sequencing-methode te combineren met streptavidine gecoate magnetische korrels met recombinant DNA-polymerase zonder 3´tot 5´exonuclease-activiteit (proof-reading) en luminescentiedetectie met behulp van het firefly luciferase-enzym. Een mengsel van drie enzymen (DNA-polymerase, ATP-sulfurylase en vuurvliegluciferase) en een nucleotide (dNTP) wordt toegevoegd aan enkelstrengs DNA dat moet worden gesequeneerd en de opname van nucleotide wordt gevolgd door meting van het uitgezonden licht. De intensiteit van het licht bepaalt of 0, 1 of meer nucleotiden zijn opgenomen, zodat wordt aangetoond hoeveel complementaire nucleotiden op de sjabloonstreng aanwezig zijn. Het nucleotidenmengsel wordt verwijderd voordat het volgende nucleotidenmengsel wordt toegevoegd. Dit proces wordt herhaald met elk van de vier nucleotiden totdat de DNA-sequentie van de enkelstrengs template is bepaald.
Een tweede op een oplossing gebaseerde methode voor pyrosequencing werd in 1998 beschreven door Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen en Pål Nyren. Bij deze alternatieve methode wordt een extra enzym apyrase geïntroduceerd om nucleotiden te verwijderen die niet door de DNA-polymerase worden opgenomen. Hierdoor kon het enzymmengsel met DNA-polymerase, luciferase en apyrase bij het begin worden toegevoegd en gedurende de hele procedure worden bewaard, waardoor een eenvoudige opstelling ontstaat die geschikt is voor automatisering. Een op dit principe gebaseerd geautomatiseerd instrument werd het jaar daarop door het bedrijf Pyrosequencing op de markt gebracht.
Een derde microfluïdische variant van de Pyrosequencing methode werd in 2005 beschreven door Jonathan Rothberg en medewerkers bij het bedrijf 454 Life Sciences. Deze alternatieve aanpak voor Pyrosequencing was gebaseerd op het oorspronkelijke principe van het hechten van het te sequencen DNA aan een vaste drager en zij toonden aan dat sequencing kon worden uitgevoerd op een zeer parallelle wijze met behulp van een microgefabriceerde microarray. Dit maakte high-throughput DNA-sequencing mogelijk en er werd een geautomatiseerd instrument op de markt gebracht. Dit werd het eerste “next generation sequencing”-instrument waarmee een nieuw tijdperk in het genoomonderzoek werd ingeluid, met snel dalende prijzen voor DNA-sequencing waardoor sequencing van het volledige genoom tegen betaalbare prijzen mogelijk werd.